الليزر التقاط تسليخ مجهري من الإنسان البروستات الظهارة لتحليل الحمض النووي الريبي
Summary
The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
Abstract
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
Introduction
غدة البروستاتا هو نسيج غير متجانسة تتكون من ظهارة إفرازية مرتبة في عنيبات غدي محاط عضلي ليفي سدى تتألف أساسا من العضلات الملساء 1. وتتألف المقصورة الظهارية من خمسة أنواع مختلفة من الخلايا ولكن المنظمة: الخلايا القاعدية والخلايا الإفرازية، خلايا الغدد الصم العصبية والخلايا العابر تضخيم والخلايا الجذعية 2. في سرطان البروستاتا (PCA)، الذي ينشأ من الخلايا الظهارية اللمعية، نمو غدية يسبب الانخفاض التدريجي الواضح من المقصورة اللحمية 3. لهذه الأسباب، فإن عينات الأنسجة لديها اختلافات واضحة في نسبة اللحمية ونوع الخلايا الظهارية على أساس مدى محكمة التحكيم الدائمة. هذه الاختلافات يمكن أن يؤدي إلى الافتراضات متحيزة للبيانات التعبير الجيني تم الحصول عليها من أنسجة كاملة دون النظر إلى تسليخ مجهري من نوع الخلايا المطلوبة. لذلك، لإزالة هذا التحيز من الضروري فصل أنواع الخلايا قبل استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير الجيني.
Macrodissection أو تسليخ مجهري يمكن استخدامها لفصل جسديا المناطق الظهارية تتميز جيدا من سدى المحيطة 4 -6. وعادة ما يتم Macrodissection بشفرة حلاقة تحت المجهر تشريح ويعمل بشكل جيد لفصل كبير PCA العقيدات من سدى، ولكنها ليست قادرة على إزالة ظهارة حميدة من المحيط سدى (انظر مثال حميدة الأنسجة البروستاتا في الشكل 1). تسليخ مجهري مع ليزر (LCM) هو أكبر بكثير من العمل المكثف من macrodissection، ولكن يمكن تشريح دقيق للغاية ظهارة حميدة 4.
وقد أظهرت المنشورات الحديثة من مختبرنا أن RNA يمكن استخراجها بنجاح LCM إما جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) الخزعات الثابتة الفورمالين أو الأنسجة المجمدة 4،7-9. التحديات الرئيسية في استخراج LCM-RNA هي 1) لتشريح دقيق للمناطق المطلوب من الأنسجة، و2) للحفاظ RNA سلامة خلال (4،10) LCM وعزل العملية. RNA معزولة عن السكان الخلية نقية يمكن استخدامها لتحليل التعبير الجيني عن طريق عدة طرق منها العكسية النسخ PCR الكمي (RT-QPCR) 7،8، ميكروأري 11، و-sequencing عمق 12-14.
والهدف من هذا البروتوكول هو عزل الحمض النووي الريبي مجموع من ظهارة LCM البروستاتا من الأنسجة المجمدة ليحلل المصب التعبير الجيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
التنميط الجيني التعبير من العينات البشرية يمكن أن يكون تحديا، ليس فقط بالنسبة للنوعية أو كمية من النسيج المتاحة، ولكن أيضا لمختلف الكيانات النسيجية الموجودة في عينة نسيج معين. هذا هو تحديا من نوع خاص في البروستاتا الذي أنسجة حميدة إلى حد كبير الأنسجة اللحمية ومجالا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
Materials
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4,0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
Referências
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
- McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
- Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
- Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
- Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
- Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
- Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95 (2010).
- Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165 (2010).
- Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
- Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
- Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
- Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
- Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246 (2014).
