Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse
Summary
The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
Abstract
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
Introduction
Die Prostata ist eine heterogene Gewebe des sekretorischen Epithels in Drüsenacini durch fibromuskuläre Stroma in erster Linie aus der glatten Muskulatur 1 komponiert umgeben angeordnet sind. Basalzellen, sekretorischen Zellen, neuroendokrinen Zellen, Transit Verstärken und Stammzellen 2: Die Epithelzellen Fach besteht aus fünf verschiedenen, aber organisierter Zelltypen besteht. Bei Prostatakrebs (PCa), die sich von den luminalen Epithelzellen entsteht, das Wachstum des Adenokarzinoms bewirkt eine evident allmählichen Rückgang des Stroma 3. Aus diesen Gründen werden Gewebeproben deutliche Unterschiede im Verhältnis von stromalen und epithelialen Zelltyp auf der Basis des Ausmaß der PCa haben. Diese Unterschiede können zu Verzerrungen der Annahmen der Genexpressionsdaten von ganzen Geweben ungeachtet Mikrodissektion der gewünschten Zelltyp gewonnen führen. Daher ist es wichtig, diese Vorspannung zu entfernen, um Zelltypen vor der RNA-Extraktion und TrennungGenexpressionsanalyse.
Macrodissection oder Mikrodissektion verwendet werden, um physisch zu trennen gut charakterisierten epithelialen Bereichen von der umgebenden Stroma 4 -6 werden. Macrodissection wird typischerweise mit einer Rasierklinge unter einem Präpariermikroskop gemacht und funktioniert gut zum Trennen großer PCa Knötchen vom Stroma, aber ist nicht fähig zur Entfernung von gutartigen Epithel von umgebenden Stroma (siehe Beispiel benigner Prostata Histologie in Abbildung 1). Mikrodissektion mit einem Laser (LCM) wesentlich arbeitsintensiver als macrodissection, aber sehr genau sezieren gutartige Epithel 4.
Aktuelle Veröffentlichungen aus unserem Labor haben gezeigt, dass RNA erfolgreich durch LCM entweder aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Biopsien oder gefrorenen Gewebe 4,7-9 extrahiert werden. Die großen Herausforderungen in LCM-RNA-Extraktion sind 1), genau zu sezieren die gewünschten Bereiche des Gewebes, und 2) zur Erhaltung RNA Integrität während des LCM und Isolierungsverfahren 4,10. RNA aus reinen Zellpopulationen isoliert können zur Genexpressionsanalyse durch mehrere Verfahren einschließlich Reverse-Transkription quantitative PCR (RT-qPCR) 7,8 Microarray 11 und tiefe -sequencing 12-14 verwendet werden.
Ziel dieses Protokolls ist es, Gesamt-RNA aus LCM Prostataepithel aus gefrorenem Gewebe zu isolieren, für nachgeschaltete Genexpressionsanalysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genexpressionsprofile von Humanproben kann eine Herausforderung sein, nicht nur für die Qualität oder Quantität von Gewebe zur Verfügung, sondern auch für die verschiedenen histologischen in einem bestimmten Gewebeprobe vorhanden Entitäten. Dies ist eine besondere Herausforderung in der Prostata, in der gutartigen Gewebe sind weitgehend stromalen Geweben und Bereichen Krebs frei von Stroma. LCM ermöglicht physikalische Trennung Prostatastroma und Epithel-RNA für eine genauere Signatur der zwei verschiedenen Zell…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
Materials
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4,0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
Referências
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