Laser-capture Microdissezione di Human prostatica Epitelio per l'analisi di RNA
Summary
The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
Abstract
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
Introduction
La prostata è un tessuto eterogeneo composto da epitelio secernente disposti in acini ghiandolari circondato da stroma fibromuscolare composta principalmente da muscolatura liscia 1. Il vano epiteliale è composto da cinque diversi tipi di cellule, ma organizzati: cellule basali, cellule, cellule neuroendocrine secretoria, cellule amplificazione di transito e cellule staminali 2. Nel cancro della prostata (APC), che deriva dalle cellule epiteliali luminali, la crescita del adenocarcinoma provoca un evidente declino progressivo del vano stromale 3. Per queste ragioni, campioni di tessuto saranno chiare differenze nella proporzione di stromali e cellule epiteliali tipo basato sulla misura dei PCA. Queste differenze possono portare a ipotesi di parte dei dati di espressione genica acquisiti dai tessuti interi senza riguardo per microdissezione del tipo cellulare desiderato. Pertanto, per eliminare questa tendenza è indispensabile separare tipi cellulari prima dell'estrazione dell'RNA eanalisi di espressione genica.
Macrodissection o microdissezione possono essere utilizzati per separare fisicamente aree epiteliali ben caratterizzati dallo stroma circostante 4 -6. Macrodissection è tipicamente fatto con una lama di rasoio sotto un microscopio da dissezione e funziona bene per separare grande PCa noduli da stroma, ma non è in grado di rimuovere dell'epitelio benigna da stroma circostante (vedi esempio di iperplasia prostatica istologia in figura 1). Microdissezione con un laser (LCM) è significativamente più manodopera rispetto macrodissection, ma può sezionare molto preciso epitelio benigna 4.
Pubblicazioni recenti del nostro laboratorio hanno dimostrato che l'RNA può essere estratto con successo da LCM da entrambi inclusi in paraffina (FFPE) biopsie fissati in formalina o tessuti congelati 4,7-9. Le principali sfide a estrazione LCM-RNA sono 1) a sezionare con precisione le aree desiderate del tessuto, e 2) per preservare RIntegrità NA durante il 4,10 LCM e isolamento del processo. RNA isolato da popolazioni cellulari pure può essere utilizzato per l'analisi di espressione genica in diversi modi tra cui trascrizione inversa PCR quantitativa (RT-qPCR) 7,8, microarray 11, e profondo -sequencing 12-14.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare RNA totale da LCM prostatico epitelio dal tessuto congelato per le analisi di espressione genica a valle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Profilo di espressione genica da campioni umani può essere impegnativo, non solo per la qualità o la quantità di tessuto a disposizione, ma anche per le diverse entità istologiche presenti in un dato campione di tessuto. Ciò è particolarmente impegnativo nella prostata in cui tessuti benigni sono in gran parte i tessuti stromali e le aree di cancro sono privi di stroma. LCM facilita separazione fisica di stroma prostatico e l'epitelio RNA per una firma più accurata dei due diversi tipi di cellule (Fig…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
Materials
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4,0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
Referências
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