Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA
Summary
The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
Abstract
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
Introduction
בלוטת הערמונית היא רקמה הטרוגנית מורכבת מאפיתל ההפרשה מסודר בacini בלוטות מוקפים stroma fibromuscular מורכב בעיקר של שריר חלק 1. תא אפיתל מורכב מחמישה סוגי תאים שונים, אך מאורגנים: תאי בסיס, תאי הפרשה, תאים נוירואנדוקריניים, תאי הגברת מעבר ותאי גזע 2. בסרטן הערמונית (PCA), הנובע מתאי אפיתל luminal, הצמיחה של אדנוקרצינומה גורמת ירידה הדרגתית מאליי של תא סטרומה 3. מסיבות אלה, יהיו דגימות רקמת הבדלים ברורים בשיעור של סטרומה וסוג תא אפיתל המבוסס על היקף PCA. הבדלים אלה יכולים להוביל להנחות מגמתיות של נתונים ביטוי גנים שנרכשו מכל רקמות ללא קשר לmicrodissection של סוג התא הרצוי. לכן, כדי להסיר הטיה זו היא חיוני על מנת להפריד בין סוגי תאים לפני מיצוי RNA וניתוח ביטוי גנים.
Macrodissection או microdissection ניתן להשתמש כדי להפריד פיזי אזורי אפיתל מאופיינים היטב מסטרומה סביב 4 -6. Macrodissection נעשה בדרך כלל בסכין גילוח תחת מיקרוסקופ לנתח ועובד היטב להפרדת PCA הגדולה גושים מסטרומה, אבל הוא לא מסוגל להסיר אפיתל השפיר מסביב סטרומה (ראה דוגמא של היסטולוגיה ערמונית שפירה באיור 1). Microdissection עם לייזר (LCM) הוא באופן משמעותי יותר מאשר עבודה אינטנסיבי macrodissection, אבל מאוד מדויק יכול לנתח אפיתל השפיר 4.
הפרסומים אחרונים מהמעבדה שלנו הראו כי RNA ניתן לחלץ בהצלחה על ידי LCM משתי ביופסיות-קבוע פורמלין מוטבע פרפין (FFPE) או רקמה קפוא 4,7-9. האתגרים המרכזיים בחילוץ LCM-רנ"א הם 1) לנתח במדויק את האזורים הרצויים של הרקמה, ו- 2) לשמר Rשלמות NA במהלך 4,10 תהליך LCM והבידוד. RNA מבודד מאוכלוסיות תאים טהורות יכול לשמש לניתוח ביטוי גנים על ידי מספר שיטות כולל הפוך-שעתוק PCR כמותי (RT-qPCR) 7,8, microarray 11, ו-sequencing העמוק 12-14.
המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד RNA הכולל מהאפיתל של הערמונית LCM מהרקמה קפוא לביטוי גנים במורד הזרם מנתח.
Protocol
Representative Results
Discussion
ביטוי גני פרופיל מדגימות אנושיות יכול להיות מאתגר, לא רק לאיכות או כמות הרקמה זמינה, אלא גם לגופים היסטולוגית השונים קיימים בדגימת רקמה נתון. זה מאתגר במיוחד בערמונית שבו רקמות שפירות הן במידה רבה רקמות ואזורים של סרטן סטרומה הן נטולי סטרומה. LCM מאפשר הפרדה פיזית של ס?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
Materials
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4,0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
Referências
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
- McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
- Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
- Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
- Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
- Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
- Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95 (2010).
- Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165 (2010).
- Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
- Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
- Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
- Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
- Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246 (2014).
