Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için
Summary
The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.
Abstract
During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.
Introduction
Xenopus laevis yumurta ekstraktı, hücre içermeyen tahlil basitliği karmaşık hücresel olayları incelemek için güçlü ve geniş ölçüde uygulanan bir araçtır. Lohka ve Masui 1 ile ilk bilgi oldukları için yaygın olarak bu kromatin yoğunlaşması 2, spiralin bir araya gelmesi 3, çekirdek zarı arıza 4 değil, aynı zamanda Nükleositoplazmik taşıma 5 ya da DNA replikasyonu 6 gibi mitotik süreçleri incelemek için kullanılmıştır. Nükleer zarf Reformasyon ve nükleer gözenek kompleksi tekrar monte olarak interphasic çekirdeğinin reform için gerekli mitoz sonunda gerçekleşen olaylar, erken mitotik olaylara nazaran anladığınızı daha az ama benzer Xenopus yumurta özü 7 kullanılarak incelenebilir. Biz son zamanlarda mitoz 8 yılı sonunda kromatin yoğunluk azaltılmasından okumak için Xenopus yumurta özü dayalı bir tahlil kurduk, bir altı-incelenmiştir süreç i bekliyor olduğunuAyrıntılı karakterizasyonu ts.
Metazoan'da olarak, kromatin yüksek genetik materyalin sadakatle ayrılmasını gerçekleştirmek için, mitotik girişinde yoğunlaştırılır. Kromatin interfaz sırasında gen ifadesi ve DNA replikasyonu için erişilebilir olduğundan emin olmak için, mitoz sonunda de-sıkıştırılmış olması gerekir. Omurgalılarda, kromatin kadar mitotik sıkıştırma genellikle çok daha düşük olan mayalar aksine, S., örneğin, sadece iki kat interfaz 9 göre mitoz sırasında daha fazla sıkıştırılmış elli misli cerevisiae 10. Omurgalı kromatin Dekondenzasyon çoğunlukla yumurta döllenmeden sonra sperm DNA yeniden düzenlenmesi bağlamında ele alınmıştır. Moleküler bir mekanizma, hangi nükleoplasmin, bol oosit proteini, yumurta saklanan histon H2A ve H2B sperm özgü protaminler değiştirir. Bu süreç aynı zamanda Xenopus yumurta özü 11, 12 kullanılarak aydınlatılmıştır. Bununla birlikte, sentezlemenükleoplasmin bu sperm özgü protaminler içermeyen oosit 13 ve mitotik kromatine sınırlıdır. Dolayısıyla mitoz sonunda yoğunluk azaltılmasından kromatin 8 bağımsız nükleoplasmin olduğunu.
In vitro Dekondenzasyon reaksiyonu için biz senkronize HeLa hücrelerinden izole aktif X. laevis yumurta ve kromatin kümelerden oluşan özü kullanır. Bir kalsiyum iyonofor ile yumurta tedavisi döllenme sırasında sperm girişi tarafından oluşturulan oosit içine kalsiyum salınımını taklit eder. Kalsiyum dalgası ilk interfaz 14 ilerler, mayoz ikinci metafaz tutuklandı hücre döngüsü yeniden başlamasını ve yumurta, tetikler. Bu nedenle, form aktive yumurta hazırlanan yumurta ekstreleri mitotik çıkış / interfaz durumunu temsil ve kromatin yoğunlaşması, nükleer zarf gibi mitotik çıkış için belirli olayları uyarmak için yetkili ve karmaşık reform gözenek. Mitotik ch izolasyonu içinkümeler romatin biz kromozom kümeleri HeLa hücrelerinde mitoz senkronize ve degrade santrifüj ile poliamin içeren tamponlar izole gelen lizis tarafından yayımlanan Gasser & Laemmli 15, yayınladığı protokol biraz değiştirilmiş bir versiyonu kullanılmış.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus Yumurta ekstreleri sadakatle in vitro hücresel süreçleri yeniden üretmek için çok yararlı bir araç olduğunu laevis ve bu sistem başarıyla hücre döngüsü ve hücre bölünmesi olayları 2, 3,5,6,17 karakterizasyonu kullanılmıştır. Nedeniyle Oogenezinde sırasında yumurta münzevi nükleer parçaların büyük mağazalar, yumurta ekstreleri hücresel bileşenleri mükemmel bir kaynağıdır. Memeli doku hücre hatları veya genetik manipülasyon R…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AKS 1 & 2 Gelişimsel Cell 31 (3), Magalska yeniden basıldı edilir Şekil Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı ve ERC (wa için AN377 / 3-2 ve 309.528 CHROMDECON) ve Boehringer Ingelheim Fonds doktora Bursu ile desteklenmiştir ve diğ. mitoz, 305-318, 2014 yılı sonunda kromatin yoğunlaşması halinde, RuvB benzeri ATPazlar fonksiyonu, Elsevier tür izni ile.
Materials
| spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
| spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
| high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
| thymidine | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
| 37 % formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
| trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptin | Roth | CN334 | |
| aprotinin | Roth | A162.3 | |
| Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
| heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogenizer (40 mL tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
| L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
| syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
| creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
| centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 1000 µL) | Biozym | 729065 | |
| 50 % glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 mL | toxic |
| 0.1 % (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 mL | |
| flat-bottom tubes (6 mL, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
| tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µL) | Biozym | 729055 | |
| 12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |
Referências
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
- Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
- Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
- Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
- Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
- Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
- Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
- Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
- Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
- Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
- Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
- Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
- Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
- Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
- Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
- Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
- Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).
