Porphyromonas gingivalis в качестве модельного организма для оценки интерактивности анаэробных бактерий с клеток-хозяев
Summary
This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.
Abstract
Анаэробные бактерии гораздо больше, чем аэробов во многих нишах человека, таких как кишечника, полости рта, влагалища и. Кроме того, анаэробные инфекции являются общими и часто из числа коренного населения. Способность некоторых анаэробных патогенных микроорганизмов к вторжению клетки человека дает им адаптивные меры побега врожденный иммунитет, а также модулируют поведение клеток-хозяев. Однако, убедившись, что анаэробные бактерии живут при экспериментальном исследовании событий может создать проблемы. Porphyromonas gingivalis, грамотрицательные анаэробы, способен вторжения различные эукариотических без фагоцитирующих клеток. В этой статье описывается, как успешно культура и оценить способность P. gingivalis вторгнуться пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs). Были разработаны два протокола: один для измерения бактерии, которые могут успешно вторжения и выжить в хосте, а другой для визуализации бактерий, взаимодействующих с клетками-хозяевами. Эти методы требуют использования в anaeРобик камера для подачи P. gingivalis с анаэробной среде для оптимального роста.
Первый протокол основан на анализе антибактериальной защиты, которая в значительной степени используется для изучения вторжение клеток-хозяев бактериями. Тем не менее, антибиотик анализ защита ограничена; только внутриклеточные бактерии, которые культивируемых после лечения антибиотиками и клетки-хозяина лизиса измерить. Для оценки всех бактерий, взаимодействующих с клетками-хозяевами, и живых и мертвых, мы разработали протокол, который использует флуоресцентной микроскопии для изучения хозяин-патоген взаимодействия. Бактерии флуоресцентно меченных с 2 ', 7'-бис- (2-карбоксиэтил) -5- (и-6) -carboxyfluorescein ацетоксиметил эфир (BCECF-AM) и использовали для инфицирования эукариотических клеток в анаэробных условиях. После фиксации с параформальдегидом и проницаемости с 0,2% Triton X-100, клетки-хозяева помечены TRITC фаллоидином и DAPI для обозначения клеток цитоскелета и ядра, соответственно. Несколько ИМАГЭС, принятые на различных координационных центров (Z-стека) получены для височно-пространственной визуализации бактерий. Методы, используемые в данном исследовании, могут быть применены к любому обрабатываемой анаэробной и любой эукариотической типа клеток.
Introduction
Анаэробные бактерии колонизируют практически все поверхности человеческого тела. Хотя преобладает в флоры кишечной и мочеполовой путей, где концентрация кислорода низка, они также существуют на высоких уровнях на коже, во рту, носу, горле и 1. Анаэробные бактерии являются частой причиной эндогенных инфекций и часто изолированы от больных сайтов. Тем не менее, из-за их разборчивого природы, анаэробы может быть трудно выделить и культивировать. Исследования с участием анаэробных бактерий должно быть сделано в ограниченных условиях. Современные методы анаэробной-культуры позволяют исследователям имитировать настройки анаэробные, необходимые для изучения многих анаэробных лабораторных штаммов или клинических изолятов даже 2,3.
Патогенные бактерии анаэробные разработала динамичные отношения и сотрудничество с эволюцией клеток-хозяев, в которых они проживают. Большинство анаэробов чувствительны к убийству принимающей иммунного ответа до достижения infectiленные уровни. Тем не менее, некоторые патогенные бактерии выработали механизмы эвакуации из или подорвать иммунного ответа. Они достичь этой цели с помощью таких механизмов, как уклонение от иммунного распознавания, обезвреживания иммунных медиаторов, изменения клеточного иммунитета, вторжения клеток-хозяев, и изменения иммунных сигнализации 4. Porphyromonas gingivalis, грамотрицательная анаэробные причастны как в устной и внеротовые заболевания, Одним из примеров весьма адаптированной бактериальным патогеном, способной вызвать патогенные изменения в организме хозяина 5-7.
Карманы биопленки налета начисленные в глубоких трещинах, образующихся между зубами и десневой ткани слизистой оболочки может питать анаэробные бактерии, которые защищены от атмосферного кислорода 8. Эти зубодесневых карманов служить нишей для различных анаэробных патогенных микроорганизмов, таких как P. gingivalis 9. П. gingivalis является краеугольным камнем патоген, который способен переделыватьING устное микробное сообщество в целях содействия развитию и прогрессирования заболеваний пародонта 10. Это производит большое количество факторов вирулентности, которые активны в отношении широкого спектра хозяев, и белками обеспечивает механизмы для уклонения от защитных сил организма 11. Он также способен вторжения эпителиальные, эндотелиальные, фибробластов и клеток периодонтальной связки в пробирке 12-14 и в естественных условиях 15. Эффективно вторжения клеток-хозяев, Р. gingivalis может избежать иммунитет хозяина. Эффективное вторжение клетках-хозяевах позволяет не только бактерии, чтобы избежать защитные силы организма, но также служит в качестве резервуара для будущего повторной инфекции, а также изменяет клетки-хозяина. Исследования молекулярных механизмов, участвующих в адгезии и интернализации бактерии клетками-хозяевами необходимы. Исследования в нескольких лабораториях ориентирована на понимание молекулярных событий, связанных с интернализации P. gingivalis клетками-хозяевамиа также механизмов, используемых для подавления и захватить иммунный ответ и выжить враждебных защитными механизмами.
Есть много анализы, способные идентификации и характеристике патогенов, которые способны вторжения клеток-хозяев. Тем не менее, исследования в пробирке с анаэробных патогенов представляют многие экспериментальные проблемы для исследователя главным образом, потому что это трудно выполнить исследования, которые полагаются на громоздких инструментов в отсутствие кислорода. Это усугубляется тем, что эукариотические клетки требуют кислорода для роста и, следовательно, должны быть получены отдельно в культуре ткани инкубатора. Один из способов избежать таких препятствий будет проводить исследования под атмосферным кислородом, но, что бы сделать рост анаэробных бактерий невозможно. Другой способ заключается в использовании тепла убитых бактерий, чтобы заразить и изучить хост-клеточные взаимодействия. Тем не менее, существуют различия между тепловыми убитых и жизнеспособных бактерий, которые уменьшают релевантность хозяин-патоген interacti16. Это центральный учиться жизнеспособные бактерии с неизмененной выражения, взаимодействующего с клетками-хозяевами; Следовательно, способы культивирования P. для gingivalis в обстановке анаэробного даны. Кроме того, две простые рентабельные протоколы продемонстрировано оценки способности P. gingivalis быть усвоены пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs). Первый протокол основан на популярной антибиотиками анализа защиты. Хотя анализ прост, соображения при использовании анаэробных микроорганизмов приведены. Второй протокол требует использования флуоресцентного сканирующего микроскопа визуализировать взаимодействие и внутреннюю P. gingivalis. Каждый метод имеет свои ограничения и преимущества, которые будут обсуждаться, чтобы обеспечить исследователю план для изучения инвазивность анаэробных бактерий. Хотя в настоящее время рукопись изучает Р. gingivalis и HUVECs, эти протоколы могут быть использованы для многих других анаэробных бактерий, а такжеа для других типов клеток-хозяев.
Protocol
Representative Results
Discussion
Все вышеперечисленные методы могут быть использованы для разработки конкретных анализов для оценки взаимодействия анаэробных бактерий с эукариотических клетках. Тем не менее, есть несколько соображений, чтобы успешно выполнять эксперименты. Во-первых, являются микробные штаммы быт?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).
Materials
| Vinyl Anaerobic Chamber-Type B | Coy Laboratory Products | Model 2000 incubator | |
| TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood | BBL | 221261 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponin | Riedel-de Haen | 16109 | |
| Gentamicin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm Circular Coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| VectaShield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
Referências
- Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
- Willis, A. T. . Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
- Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
- Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
- Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
- Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
- Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
- Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
- Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
- Lamont, R. J., Yilmaz, &. #. 2. 4. 6. ;. Z. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
- Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
- Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
- Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
- Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
- Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
- Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
- Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
- Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
- Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
- Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
- Gospodarowicz, D. C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039 (2010).
- Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
- Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
- Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2′,7′-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
- He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
- Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
- Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
- Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
- Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
- Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
- Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
- Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
- Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616 (2014).
- Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226 (2013).
- Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
- Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).
