خلية السرطان كروي الفحص لتقييم الغزو في إعداد 3D
Summary
This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.
Abstract
The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.
Introduction
ثبت أن الحركة الخلايا السرطانية هي التنبؤية المحتملة المتنقل، بالنظر إلى أن مثل هذا السلوك يسهل الغزو من خلال الغشاء القاعدي والدخول في الدورة الدموية 1. وقد ركزت معظم البحوث على الحركة على كيفية سلوك الخلايا في ثنائي الأبعاد (2D) الإعداد، على الرغم من أنه أصبح من المسلم به على نطاق واسع أن حركة الخلايا في ثلاثية الأبعاد (3D) المصفوفة هي أكثر تمثيلا لكيف يمكن لهذه الخلايا نفسها سوف فعلا تتصرف في الجسم الحي 2. وتستخدم نظم الاستزراع 3D على نحو متزايد لدراسة السلوكيات الخلوية التي تتراوح من مورفولوجيا الخلايا، لحركية النمو وحساسية العقاقير 3. وقد أدى الرغبة في رصد سرطان غزو الخلايا في إطار محيط 3D لتوليف التقنيات المحددة سابقا التي تنطوي على جيل من المجاميع خلية 3D (الكروية) عن طريق أسلوب ثقافة الإفلات شنقا 4، تليها تضمين هذه الأجسام الشبه الكروية إلى خارج الخلية 3D مصفوفة (ECM) تتألف من الكولاجين والغشاء القاعدي المواد 5. ويسعى هذا الأسلوب إلى تحسين هذه التقنيات المحددة سابقا من خلال توفير نهج مبسط التي يمكن استخدامها بسهولة لمقارنة الغزو في إطار مجموعة من الظروف التجريبية.
الطرق التقليدية أكثر لتقييم حركية الخلية في المختبر هي فحص الجرح الصفر وفحص transwell 6. الفحص السابق يصور حركية الخلية في وضع 2D، وبالتالي فهي مستقلة عن مجموعة متنوعة من الميزات الهامة في الجسم الحي الغزو، مثل نشاط الأنزيم البروتيني 7. مقايسة transwell يمكن غزو الخلايا نموذج أفضل عندما تكون مغلفة يدرج بشكل جيد مع ركائز ECM، ولكن فقط معلمة واحدة، أي ظهور الخلايا على العكس سطح غشاء يقاس، والعديد من الفروق الدقيقة من غزو الخلايا وبالتالي لا يمكن ملاحظتها بسهولة. وعلى النقيض من هذه التقنيات، وفحص الخلايا السرطانية غزو كروي (الشكل 1 </ قوي>) يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من غزو الخلايا في إعداد هذا ليس من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة فقط، ولكن أيضا يسمح الميزات الهامة خلية خط محدد لأن تصور، مثل هجرة الخلايا الفردية مقابل الجماعية 8. هذا الأسلوب يتيح أيضا مزايا أكثر من فحوصات النمو الثقافة 3D القياسية. توليد المجاميع الخلوية عبر طريقة انخفاض شنقا يحد في البداية حركة الخلية، بحيث يتم تحفيز الخلايا لغزو بعد رفع هذا القيد. وعلاوة على ذلك، حالما يتم رفع هذا القيد، والخروج خلية تسير في اتجاه موحد ويمكن بعد ذلك quantitated مريح.
المواد ECM الأكثر شعبية المستخدمة في الخلايا السرطانية الكروية المقايسات Matrigel والنوع الأول الكولاجين، حيث كل عنصر من هذه العناصر أدوارا هامة ومميزة في التأثير على سلوك النقيلي. Matrigel هو خليط يفرز من البروتينات التي تنتجها الخلايا ساركوما Engelbreth-هولم سرب الماوس، وأثرت في basemeبروتينات الغشاء الإقليم الشمالي مثل laminin، entactin، والنوع الرابع الكولاجين 9. لهذا السبب Matrigel يشار من الآن فصاعدا باسم "المواد الغشاء القاعدي". وتوفر هذه المواد الغشاء القاعدي بروابط الأساسية اللازمة لإنتغرين التصاق خلال السرطان غزو الخلايا 10 بالإضافة إلى العديد من البروتينات الأخرى التي تمارس مجموعة من الآثار على سلوك الخلية 11. في المقابل، النوع الأول الكولاجين، الذي أعد عادة من هضم الحمض الأوتار والهياكل الكولاجينية الكثيفة، 12، هو مادة مصفوفة أبسط من ذلك بكثير التي هي بمثابة العنصر الهيكلي الرئيسي للأنسجة وسدى دعم الأنسجة والأعضاء الضام في الجسم. وقد ثبت أن الخصائص الفيزيائية للالكولاجين يمكن أن تنظم عددا من ملامح الحركة الخلية؛ على سبيل المثال، في محاذاة الألياف الكولاجين في واجهة للورم انسجة تسمح الخلايا السرطانية للهجرة في وقت لاحق على طول تلك الألياف عند غزو في سدى 13. في مقايسة المقدمة هنا، سواء النوع الأول الكولاجين ويتم استخدام المواد الغشاء القاعدي وسيلة لدراسة سرطان 3D خلية سدى التفاعلات.
تأثير تثبيط أو تنشيط مسارات التي تتحكم يمكن رصدها الغزو بعد أن تم جزءا لا يتجزأ من الخلايا في مصفوفة 3D. يمكن سابقة التجهيز الخلايا أثناء النمو في قطرات شنقا أو عند نقله الى ثقافة 3D، اعتمادا على ما إذا كان سوف تكون هناك حاجة إلى علاج طويل لتعديل الغزو. لعلاج أقصر، فمن المستحسن أن العقار أن تكون مختلطة مع تعليق كروي بعد جمع، وكذلك وسائل الإعلام التي ستحيط الثقافات 3D، لتسهيل التعرض الكافي للخلايا المخدرات. المقبل، خلايا انسجة طبيعية أو المرتبطة الورم يمكن ممزوجة مع مواد مصفوفة لتقييم دورها في تحوير غزو الخلايا السرطانية، أو لتحديد كيفية يشير التأثيرات سلوك الخلية نظير الصماوي وautocrine. وقد أظهرت هذه الفكرة في الدراسة حيث coculture من العقيدعلى السرطانية والخلايا البطانية في قطرات شنقا أدى إلى شبكة الأوعية الدموية داخل الكروية 14. وأخيرا، يمكن أيضا مكونات ECM يمكن تغييرها، كما يتأثر غزو الخلايا السرطانية عن طريق ركائز مختلفة 15. وبالتالي فإن الطريقة المعروضة أدناه إطارا لتقييم غزو الخلايا السرطانية في إطار مجموعة من الشروط. بشكل عام تبين أن ليس جميع خطوط الخلايا خلق الكروية في قطرات شنقا وخطوط الخلايا الظهارية المظهر عادة تشكل مجالات العادية.
Protocol
Representative Results
Discussion
قيمت هذه الدراسة أداء لجنة من خطوط الخلايا السرطانية في مقايسة غزو كروي (الجدول 1). عموما، نجد أن تتعزز تشكيل كروي في المزيد من خطوط الخلايا الظهارية المظهر، حيث وجود تقاطعات خلية خلية يشجع على تشكيل بنية تشبه كروي. خطوط الخلايا المعروفة التي خضعت لالانتقالي?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح P30 CA051008 وT32 CA009686 (ATR).
Materials
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
Referências
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca, ., Werbowetski, D., T, ., Del Maestro, R., F, Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), .
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), .
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
