En Cancer Cell Spheroid analys för att bedöma invasion i en 3D-inställning
Summary
This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.
Abstract
The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.
Introduction
Det är klarlagt att cancer cellmotilitet är prediktiva för metastatisk potential, med tanke på att ett sådant beteende underlättar invasion genom basalmembranet och inträde i cirkulationssystemet 1. Den mesta forskningen om rörlighet har fokuserat på hur celler beter sig i en tvådimensionell miljö (2D), men det håller på att bli allmänt erkänt att förflyttning av celler i ett tredimensionellt (3D) matrisen är mer representativ för hur dessa samma celler kommer faktiskt beter sig in vivo 2. 3D kultursystem används alltmer för att studera cellulära beteenden som sträcker sig från cell morfologi, till tillväxt kinetik och läkemedelskänslighet 3. Önskan att övervaka cancercellinvasion inom ramen för en 3D-miljö har lett till syntesen av tidigare etablerade tekniker involverar genereringen av 3D-cellaggregat (sfäroider) via droppe odlingsmetod 4, följt av inbäddning dessa sfäroider till en 3D extracellulär matris (ECM) bestående av kollagen och basalmembranmaterial 5. Denna metod syftar till att förbättra dessa tidigare etablerade tekniker genom att tillhandahålla en rationell metod som lätt kan användas för att jämföra invasion under olika experimentella betingelser.
Mer traditionella sätt att bedöma cellmotiliteten in vitro är scratch lindade analys och transwell analysen 6. Den tidigare analysen visar cellmotiliteten i en 2D-miljö, och är därför oberoende av en mängd funktioner som är kritiska för in vivo invasion, t.ex. proteasaktivitet 7. Den transwell analys kan bättre modell cellinvasion när brunns skären är belagda med ECM substrat men, endast en enda parameter, dvs utseendet på celler på den motsatta membranytan mätes, och många nyanser av cellinvasion är således inte direkt kan observeras. I motsats till dessa tekniker, cancercellen sfäroid invasion analys (Figur 1 </ strong>) gör det möjligt att i realtid övervaka cellinvasion i en miljö som inte bara är fysiologiskt relevant, men tillåter också viktiga celllinjespecifika funktioner som ska visualiseras, såsom individuella kontra kollektiva cellvandring 8. Denna metod ger också fördelar jämfört med vanliga 3D kultur tillväxtanalyser. Genereringen av cellulära aggregat via hängande droppmetoden begränsar initialt cellrörelse, så att celler ska stimuleras att invadera efter denna begränsning lyfts. Dessutom, när denna begränsning lyfts, kommer cell avstigning fortsätta på ett enhetligt riktning som sedan kan enkelt kvantifieras.
De mest populära ECM material som används för cancercell sfäroider analyser är Matrigel och typ I-kollagen, där var och en av dessa komponenter har viktiga och tydliga roller i att påverka metastaserande beteende. Matrigel är en utsöndrade blandning av proteiner som produceras av Engelbreth-Holm Swarm mus sarkomceller, och anrikas i basement membranproteiner såsom laminin, entaktin och kollagen typ IV 9. Av denna anledning Matrigel är hädanefter kallad "basalmembranmaterial." Dessa källarmembranmaterial ger viktiga ligander behövs för grin vidhäftning under cancercellinvasion 10 förutom många andra proteiner som utövar en rad effekter på cellens beteende 11. I jämförelse, typ I-kollagen, som vanligen framställas från syra klyvningar av senor och andra täta kollagen strukturer 12, är en mycket enklare matrismaterial som fungerar som ett viktigt strukturelement av bindväv och stroma stödjande vävnader och organ i kroppen. Det har visats att de fysiska egenskaperna hos kollagen kan reglera ett antal funktioner för cellmotilitet; exempelvis anpassningen av kollagenfibriller vid tumör-stromala gränssnitt tillåter cancercellerna att därefter migrerar längs dessa fibriller när invaderar in i stroman 13. I analysen presenteras här, både typ I-kollagen och basalmembranmaterial används som verktyg för att studera 3D cancercell stroma interaktioner.
Effekten av inhibering eller stimulering av reaktionsvägar som kontrollerar invasionen kan övervakas efter det att cellerna har inbäddade i 3D-matris. Celler kan förbehandlas under tillväxt i de hängande dropparna eller vid överföring till 3D kultur, beroende på om en lång behandling kommer att krävas för att modulera invasionen. För kortare behandlingar, rekommenderas att läkemedlet blandas med sfäroid suspensionen efter samling, liksom den media som kommer att omge de 3D-kulturer, för att underlätta adekvat läkemedelsexponering till cellerna. Därefter kan normala eller tumörassocierade stromaceller blandas med matrismaterialet för att utvärdera deras roll vid modulering av tumörcellinvasion, eller för att fastställa hur parakrin och autokrin signalerings påverkar cellbeteende. Denna idé visades i en studie där samodling av colom cancer och endotelceller i hängande droppar ledde till en vaskulär nätverk inom sfäroiderna 14. Slutligen kan ECM beståndsdelarna också ändras, eftersom cancercellinvasion påverkas av olika substrat 15. Den metod som presenteras nedan kommer således att ge en ram för att bedöma cancercellinvasion under olika förhållanden. I allmänhet konstaterades att inte alla cellinjer skapar spheroids i hängande droppar och epitelceller proffsiga cellinjer bildar typiskt regelbundna sfärer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie utvärderade en panel av cancercellinjer i en sfäroid invasion analys (tabell 1). Generellt finner vi att sfäroid formation förstärks i de mer epitelceller proffsiga cellinjer, där närvaron av cell-cell junctions främjar bildandet av en sfäroid liknande arkitektur. Kända cellinjer som har genomgått ett epitelial-mesenkymala omvandlingar såsom MDA-MB-231-celler inte bildar sfäroider i droppe kultur mest sannolikt på grund av deras reducerade E-, N-, och P-cadherin expression <su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Med stöd av NIH bidrag P30 CA051008 och T32 CA009686 (ATR).
Materials
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
Referências
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca, ., Werbowetski, D., T, ., Del Maestro, R., F, Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), .
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), .
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
