Emulsões água em óleo: Um novo sistema para a montagem de proteínas de ligação de clorofila solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos

Summary

Este manuscrito descreve um método simples e de alto rendimento para a montagem de proteínas solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos que é base de emulsões de água-em-óleo. Demonstramos a eficácia do método na montagem de clorofilas nativas com quatro variantes de água-solúvel em clorofila recombinante proteínas de ligação (WSCPs) de plantas Brassica expressos em E. coli.

Abstract

Clorofilas (CHLS) e bacteriochlorophylls (Bchls) são os principais co-fatores que realizam a colheita de luz da fotossíntese e de transporte de elétrons. Sua funcionalidade depende criticamente sobre a sua organização específica dentro grandes complexos de proteínas e elaborados múltiplas subunidades transmembrana. A fim de compreender a nível molecular destes complexos como facilitar a conversão da energia solar, que é essencial para compreender proteína de pigmento, e interacções pigmento de pigmento, e o seu efeito sobre a dinâmica excitados. Uma maneira de ganhar tal entendimento é através da construção e estudar complexos de Chis com proteínas recombinantes solúveis em água simples. No entanto, a incorporação dos Chis e Bchls lipofílicos em proteínas solúveis em água, é difícil. Além disso, não existe um método geral que pode ser utilizado para a montagem de proteínas solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos. Aqui, demonstramos um sistema de transferência simples e alta à base de emulsões de água-em-óleo, o qual permite burroembly de proteínas solúveis em água com Chis hidrofóbicos. O novo método foi validado por reunião de versões recombinantes da proteína de ligação à clorofila solúvel em água de plantas Brassicaceae (WSCP) com Chl a. Nós demonstramos a montagem bem-sucedida de Chl A utilizando lisados ​​impuros de WSCP expressando E. célula de E. coli, que podem ser utilizados para o desenvolvimento de um sistema de tela genética para as proteínas de ligação Chl-solúveis em água novos, e para estudos de interacções proteína-Chl e processos de montagem.

Introduction

pigmentos hidrofóbicos, tais como clorofilas (CHLS), bacteriochlorophylls (Bchls) e carotenóides são os principais cofatores na centros de reação fotossintética e proteínas de colheita de luz que realizam transporte de elétrons, e captura de energia de luz e transferência. Os centros de reação e a maior parte dos complexos de colheita de luz Chl-ligação são proteínas transmembrana. A proteína Fenna-Matthews-Olson (FMO) de não oxigênicos bactérias fotossintéticas-enxofre verde ^1,2 e a proteína peridinina-Chl (PCP) de dinoflagelados ³ são exemplos excepcionais de proteínas de colheita de luz solúveis em água. A ligação de clorofila proteínas solúv....

Protocol

1. Preparar Chl um estoque Solutions

1. Passo crítico: executar todos os passos de preparação de clorofila numa hote química, sob luz verde (520 nm) ou, no escuro, a fim de minimizar o fotoenvelhecimento. Sempre adicionar azoto ou árgon antes de congelar os pigmentos para armazenamento. Assegurar que todos os solventes são grau analítico.
2. Pesar cerca de 5 mg de células Spirulina platensis liofilizadas ou outras células contendo apenas cianobactéria Chl a em tilacóides e esmagá-lo usando um almofariz e pilão.
3. Carregar células trituradas numa coluna de vidro e lava-se com cerca de 50-100 ml de acetona a 100%, a fim de remov....

Results

Apoproteínas WSCP recombinantes foram montados com um Chl em emulsões / O w de acordo com o protocolo descrito na secção anterior. O protocolo foi implementado utilizando fases aquosas contendo os WSCPs puros, ou lisados ​​de células de E. coli que sobre-expressam WSCP (Figura 1). O protocolo é simples, rápida e não requer qualquer equipamento especial, exceto um homogeneizador de tecidos.

A .......

Discussion

O nosso objectivo foi desenvolver um novo sistema para a montagem geral de proteínas de ligação a clorofila solúveis em água com pigmentos hidrofóbicos. Aqui mostra-se que o novo sistema de reconstituição com base em W / O emulsão é uma abordagem geral comprovada para o trabalho para a montagem de apoproteínas WSCP de couves de Bruxelas, couve-flor, rabanete japonês e Virginia pepperweed recombinante expressos em E. coli. Aqui os resultados são apresentados a partir de reconstituição de 1 mg de WSCP com excesso.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Óleo mineral	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartuchos	Bio Rad	10011164	Cromatografia de afinidade para purificação WSCP com sequência nativa.
Coluna His Trap HF	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Cromatografia de afinidade para purificação de WSCP com His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Meio de cromatografia para purificação de clorofila