वनस्पति कोशिकाओं के लक्षित lysis द्वारा पर्यावरण के नमूनों से endospores के भौतिक अलगाव
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
इस काम का लक्ष्य पर्यावरण के नमूनों में वनस्पति बैक्टीरियल कोशिकाओं से बैक्टीरियल endospores के विभाजन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। बैक्टीरियल endospores के गठन जाति Firmicutes 1 से संबंधित बैक्टीरियल समूहों की एक संख्या में पाए जाने वाले एक जीवन रक्षा रणनीति है, आमतौर पर भुखमरी से शुरू हो रहा है। Endospore के गठन बैक्टीरिया अच्छी तरह से उपभेदों के एक नंबर रोगजनकों और इसलिए चिकित्सा महत्व (जैसे, बेसिलस anthracis या क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम) के हैं, जिसका मुख्य कारण अध्ययन कर रहे हैं। Endospore के गठन बैक्टीरिया के पर्यावरण उपभेदों लगभग हर पर्यावरण (मिट्टी, पानी, तलछट, हवा, बर्फ, मानव आंत, जानवरों के पेट, और अधिक) 1-3 से पृथक किया गया है। इसलिए, Firmicutes संस्कृति संग्रहों 4 में दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में जाति हैं।
क्योंकि उनके हार्डी बाहरी कोर्टेक्स और सुरक्षात्मक कोर प्रोटीन की, endospores fr लेकर चरम पर्यावरण की स्थिति जीवित रह सकते हैंउच्च विकिरण, अत्यधिक तापमान और हानिकारक रसायनों से 5 ओम सुखाना। यह उल्लेखनीय प्रतिरोध यह endospores 6-8 से डीएनए निकालने के लिए एक चुनौती बना देता है। वे पर्यावरण अनुक्रमण के अध्ययन 9,10 में अनदेखी की गई है कि क्यों यह संभावना बताते हैं। जैसे फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी 11 से पर्यावरण के नमूनों में endospores के लक्षित कर के रूप में अन्य तरीकों, मिट्टी 12 और तलछट 13 में dipicolinic एसिड की मात्रा का ठहराव (डीपीए), 14 प्रवाह cytometry या pasteurization और बाद में खेती 15,16 में endospores पुनः प्राप्त या यों इस्तेमाल किया गया है पर्यावरण के नमूनों। हाल के वर्षों में, अनुकूलित डीएनए निष्कर्षण तरीकों के साथ ही विशिष्ट आणविक प्राइमरों endospore विशिष्ट जीन दृश्यों 10,17-20 विकसित किया गया है लक्षित करने के लिए। इस बैक्टीरिया 21 के इस समूह के बीच और अधिक जैव विविधता प्रकट करने के लिए मदद की है और यह भी endospores का पता लगाने के लिए उद्योग और चिकित्सा के क्षेत्र में आवेदन करने के लिए प्रेरित किया हैदूध पाउडर 19 में, उदाहरण के लिए।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल कोशिकाओं वनस्पति के सापेक्ष बैक्टीरियल endospores (जैसे गर्मी और डिटर्जेंट के रूप में) हानिकारक भौतिक परिस्थितियों के प्रतिरोध में अंतर पर आधारित है। एक नमूने में वनस्पति कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए, हम लगातार गर्मी, लाइसोज़ाइम और डिटर्जेंट की कम मात्रा लागू होते हैं। बीजाणुओं को नष्ट करने के लिए है, लेकिन सभी वनस्पति कोशिकाओं lyse करने के रूप में नहीं तो इन उपचार के समय और शक्ति अनुकूलित किया गया है। एक पर्यावरण सेल पूल में कुछ कक्षों में दूसरों की तुलना में अधिक प्रतिरोधी रहे हैं, तो सभी वनस्पति कोशिकाओं को नष्ट करने की संभावना को बढ़ाने के लिए, हम तीन अलग उपचार लागू होते हैं। इस विधि के लाभ और नवीनता उपचार के बाद endospores अभी भी बरकरार हैं और आगे बहाव के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये घ को कम करने, इस प्रकार डीएनए निष्कर्षण, मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) और amplicon या विशेष endospores के समूह को लक्षित metagenomic अनुक्रमण (और शामिलiversity,) कवरेज में वृद्धि करते हुए। endospores भी नीचे की ओर खेती या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रवाह cytometry, या डीपीए का पता लगाने। इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण विशेषता एक इलाज नमूना के साथ एक अनुपचारित नमूना तुलना करके, एक कोशिकाओं वनस्पति के लिए इसी घटक के अलावा एक पर्यावरणीय नमूने में endospores की मात्रा और विविधता परिणाम निकालना कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
बाहरी आक्रामक भौतिक कारकों (जैसे, तापमान या डिटर्जेंट) को endospores के विरोध को पर्यावरण के नमूनों में वनस्पति कोशिकाओं से बैक्टीरियल endospores अलग करने के लिए एक तरीका ईजाद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। य?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों अनुदान सं 31003A-132358/1, 31003A_152972 और नंबर 151,948 के लिए स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन को स्वीकार करते हैं, और Fundation पियरे मर्सिए ला विज्ञान डालना।
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
References
- Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
- Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
- Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America’s Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
- Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
- Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
- Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
- Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. . Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , (2004).
- Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
- von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
- Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
- Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
- Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
- Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
- de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
- Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
- Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
- Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
- Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
- Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
- Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).
