Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.
Alpha-synuclein (α-syn) proteinet er rikelig uttrykt hovedsakelig innenfor neuroner, og finnes i en rekke forskjellige former – monomerer, tetramerer og oligomerer fibriller. I løpet av sykdommen, gjennomgår α-syn konformasjonsendringer å danne oligomerer og høymolekylære aggregater som har en tendens til å gjøre proteinet uløselig mer. Unormalt aggregert α-syn er en nevropatologiske trekk ved Parkinsons sykdom (PD), demens med Lewy-legemer (DLB) og multippel system atrofi (MSA). Biokjemisk karakterisering og analyse av uoppløselige a-syn ved hjelp av buffere med økende vaskemiddel styrke og høy hastighet ultrasentrifugering gir et kraftig verktøy for å bestemme utviklingen av α-syn patologi assosiert med sykdomsprogresjon. Denne protokollen beskriver isolering av stadig uløselig / aggregert α-syn fra post-mortem menneskelig hjernevev. Denne metodikken kan tilpasses med modifikasjoner til studier av normale og unormale α-syn biologi i transgene dyremodeller som bærer forskjellige a-syn-mutasjoner, så vel som i andre nevrodegenerative sykdommer som har avvikende fibrillære avsetninger av proteiner som er relatert til deres respektive patologier.
En av de viktigste patologiske trekk felles blant flere neurodegenerative sykdommer er dannelsen av unormale proteinaggregater som oppstår i et protein / sykdomsspesifikk måte en. Dermed er det de karakteristiske extraneuronal amyloid-beta plakk og aggregerte hyperfosforylert tau forekomster innenfor nevroner i Alzheimers sykdom (AD); de aggregerte a-syn innskudd i Lewy-legemer (LBS) som er intranevronale slutninger, og også innenfor dystrofiske nevronale prosesser kalt Lewy neuritter (LNS) i PD, PD demens og demens med Lewy-legemer (DLBs) 2-4. Unormale a-syn depositum kan også ses i kjennetegn lesjoner av gliaceller cytoplasmatiske slutninger i MSA 5. I Huntingtons sykdom, det er de karakteristiske Poly-Q innskudd, og unormal Tar DNA-bindende protein-43 og smeltet i sarkom proteiner (FUS) er avsatt i frontotemporal demens. Viktigere for PD, har α-syn genmutasjoner blitt funnet å cause autosomal dominant PD 6-11. I tillegg α-syn genet triplication 12 og duplisering 13 fører også familiær PD og dermed knytte økt α-syn uttrykk til pathomechanisms av PD. Spesielt, både sporadiske og familiære PD-tilfeller båtplass unormale forekomster av α-syn patologi 14. Nåværende tilgjengelige behandlinger for PD er kun palliativ og har ingen effekt på å stanse eller forsinke den ubønnhørlige sykdomsprogresjon.
α-syn er rikelig uttrykt i den menneskelige hjerne og utgjør ca 1% av den totale hjerne protein. Det er til stede mer spesifikt i de neuroner, men kan eksistere om enn i lavere mengder innen gliaceller. En omstridte punkt er den opprinnelige struktur av α-syn, som kan eksistere som en tilfeldig monomer 15 eller som en foldet tetramer 16. I løpet av sykdommen, forandrer α-syn dens konformasjon som gjør at den kan bli misfolded og denne prosessen er antatt å være årsaken til sykdommen pathogeNesis. Til tross for flere år med etterforskning av patofysiologiske aspekter av α-syn og sykdom, har de nøyaktige årsakene til sykdomsmekanismer vært unnvikende 14.
Studier ved hjelp av post-mortem analyse av Parkinson hjerner har så langt gitt viktige ledetråder om normal og unormal biologi α-syn både i sporadisk PD og også PD assosiert med mutasjoner i LRRK2 genet 17-22. Her har en biokjemisk ekstraksjon protokoll (se skjema vist i figur 1) for i økende grad uoppløselige a-syn-innskudd fra humant post-mortem PD hjernevev som havn α-syn-aggregater i varierende grad blitt beskrevet. Denne teknikken kan også bli tilpasset med modifikasjoner i bufferblandinger for å studere aggregerte proteiner fra andre nevrodegenerative sykdommer 23,24, og også fra transgene dyr hjernevev 25-27. Det viktigste hensynet for tilpasninger er forskjellene i solubiheten og de totale mengder av de respektive proteiner, hvorav noen er i hovedsak atom og kan ha behov for høy-saltbuffer for optimal ekstraksjon som vist for FUS 28.
Denne artikkelen beskriver en biokjemisk protokoll for ekstrahering og undersøkelse av de differensielle løselighetsegenskapene til monomere, oligomere og aggregeres α-syn fra syke hjernene ved hjelp av denaturerende gel driftsforhold. Dette er en veletablert teknikk for å studere aggregert α-syn 17, 18, 20, 21 et protein som normalt er oppløselig i sin native form, men får amyloidogene eller økt aggregering egenskaper med sykdomsprogresjon eller med genetiske mutasjoner. Likevel har noen grupper benyttet små variasjoner i SDS-konsentrasjoner i sine buffere (8% eller 10% i stedet for 5%) 21,22, 30. SDS er en anionisk detergent og solubilises α-syn-oligomerer som kan inneholde membranbundne former av α-syn, mens urea, denatures et kaotropt reagens de uløselige aggregert og fibrillære eller amyloidogene former av α-syn-20. I denne forbindelse en systematisk studie av Paleologou et al 31 undersøkte stabilitetenav a-syn-oligomerer og fibriller med varierende konsentrasjoner av urea (6,5 – 8 M) eller SDS (0,25-2%) og rapporterte at oligomerer stabile i SDS-konsentrasjoner, men ikke med høye konsentrasjoner av urea. Deres FILA-1 antistoff, spesifikt for a-SYN oligomerer og fibriller oppdaget høyere konsentrasjoner av fibriller 6.5 M urea konsentrasjoner under ikke-denaturerende forhold. Bufferkonsentrasjonene som ble anvendt i denne protokollen tett speil det som har blitt beskrevet i Culvenor et al. (1999) 32.
Anatomiske områder av hjernen til biokjemisk utvinning av uløselig α-syn bør velges med omhu, og dette bør gjenspeile α-syn LB og LN belastning avhengig av sykdomsprogresjon 33,34. Sakene som brukes her er basal ganglia prøver fra neokortikale og limbiske subtyper av PD reflekterer sene og mellomliggende stadier av PD progresjon i henhold til McKeith ctriteria 34. På Queen Square Brain Bank, er den ene halvdelen av hjernenrutinemessig fast i formalin for histokjemisk analyse og den andre halvparten er nøye dissekert i ulike anatomiske regioner og flash frosset og lagret ved -80 o C frysere for ytterligere biokjemiske og DNA / RNA-analyse studier. Etter formalin fiksering av hjernen og disseksjon av neuropathologists er immunhistokjemi utført ved hjelp av α-syn antistoff og resultater arkivert. Også som en rutinemessig prosedyre, blir pH i hjernevevet målt ved ankomst som et mål på agonal tilstand av hjernevevet. Dette danner et solid grunnlag for kvaliteten på vevet bevaring for biokjemisk analyse.
Våre data viser her at det er flere SDS oppløselige α-syn monomer i PD-tilfeller sammenlignet med kontroller; særlig neokortikale PD-tilfeller har høyere α-syn last i forhold til det limbiske PD variasjon. De neokortikale tilfeller representerer større progresjon av PD α-syn patologi i neokortikale regioner som frontpartiet og parietal corsis 33,34. Det limbiske PD-tilfeller har høyere LB score i de basale forhjerne / limbiske regioner områder som amygdala, transentorhinal og cingulate regioner. For meningsfull data og statistisk analyse, må man kjøre minst 4 tilfeller fra hver årsklasse. Likeledes har vi ikke forsøkt statistisk analyse av de data som er presentert her blot.
Det må også bemerkes at forskjellige antistoffer kan gjenkjenne forskjellige former / sammensetningen av høyere orden a-syn-oligomerer og hver kan ha sitt eget relative følsomhet og preferanser. Dette fremgår av resultatene av Tong et al., 29 hvor de viser at 4 forskjellige a-syn-antistoffer (syn-1, SS, ONCO og LB509) gir resultater som kan endres i det minste for a-syn-oligomerer / aggregater. De α-syn-monomerer ble gjenkjent med tilsvarende grad ved alle 4-antistoff, selv om disse kan ha variasjoner avhengig av om α-syn-antistoff epitop er lokalisert enten i N-terminal eller C-terminale 29. Tilsvarende spesifikke antistoffer for fosfo-alfa-synuclein bestemme tydelig med høy molekylvekt α-synuclein arter 20,21. I den protokoll som er beskrevet her, har den høyt karakterisert antistoffet Syn-1 blitt anvendt 19-21.
Imidlertid er det viktig å vurdere validere en ny antistoff på Western blot gjennom antistoff preabsorption eksperimenter og også overekspresjon og knockdown av proteinet i cellene.
Det er viktig å vurdere andre varianter som er brukt av forskere for å avgjøre mindre fragmenter av a-syn og eller ustabile tetramer a-syn former. Dette kan omfatte milde-fiksering av membraner med 0,4% PFA i PBS for å beholde avkortede former av α-syn 35 eller behandling av prøven homogenater med kryssbindere for å stabilisere tetramers 36.
Nøyaktig biokjemiske evaluering av proteiner ved hjelp av post-mortem tissue krever minimering av enzymatisk protein degradering og modifikasjon. Det er derfor lurt å bruke vev med de korteste obduksjons forsinkelser og / eller velg matchet prøver innenfor saks kohorter. Immunhistokjemi ved å bruke standard antistoff for α-syn immunhistokjemi bør utføres før start av isolasjonsprotokoll. Omfanget av α-syn patologi er svært variabel, og kan variere i henhold til utvalgte områder. Det er lurt å velge regioner med rikelig patologi som en positiv kontroll for optimal avkastning med hvert løp. Anvendelsen av protease-inhibitorer, og hvis det er nødvendig fosfatase-inhibitorer for å hindre uønsket enzymatisk nedbrytning etter frigjøring av intracellulære proteaser eller fosfataser som forekommer i løpet av cellelysering og vedlikehold av prøvene ved 4 ° C er avgjørende.
Det er viktig at alle prøvene innenfor den gruppe av forsøk håndteres jevnt og kontinuerlig for å unngå intraElle varianter; multippel freEze-tine sykluser bør unngås da dette kan potensielt trekke post-translasjonelle modifikasjoner som fosforylering. Et kritisk punkt å huske på når du undersøker et stort antall prøver er at dataene fra immunoblotter skal være normalisert til en prøve, som skal løpe parallelt med alle andre prøver på geleer, og alle data refererte til at prøven. Dette gjøres for å sikre normalisering av Immunoblotanalyse data mellom flere blotter. Dette er den metoden som ble vedtatt i vår fersk undersøkelse 22.
Det bør bemerkes at for å holde den lave bakgrunns ECL, blottene bør ikke få lov til å tørke ut når som helst i løpet av western blot-protokollen. I tillegg bør meget lange eksponeringer (> 10 min) på autoradiografi film unngås da dette vil føre til metning av ECL-signal og vil føre til unøyaktig kvantitering.
Dette ovenfor protokollen er en relativt grei teknikk med vanlige laboratorie reagenser og iinstrumenter og kan være et verdifullt verktøy for å undersøke patofysiologien av α-syn protein i PD forskning. Denne metodikken kan ikke bare bli utvidet med passende modifikasjoner til studiet av α-syn biologi i a-syn transgene dyr, men også til andre nevrodegenerative sykdommer med unormale forekomster av aggregerte proteiner som AD, MSA, DLB, HD og frontotemporaldementias. Men de vestlige blot data som er beskrevet her kan også bli validert ved hjelp av enzymbundet immunosorbentbestemmelser bruker antistoffer for bestemte former for α-syn 31.
The authors have nothing to disclose.
I thank Dr Adamantios Mamais for extracting α-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson’s Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.
Tris-HCL | Sigma | T5912 | |
sodium chloride | VWR | 27800.291 | |
SDS | Fluka | 71727 | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Protease inhibitor tablets | Roche | 04 693 116001 | |
Phosphatase inhibitor tablets | Roche | 04 906 837001 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | P4417 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
NuPAGE MOPS SDS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
NuPAGE transfer buffer | Invitrogen | NP0006-1 | |
Hybond-P membrane | GE Healthcare | RPN303F | |
Whatman 3MM filter paper | Sigma | WHA30306185 | |
Bis-tris gels 4-12% | Invitrogen | NP0322BOX | |
Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
Bio-RAD DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | |
Thickwall Beckman Polycarbonate tubes | Beckman | 355630 | |
Western blot stripping buffer | Thermo scientific | 46430 | |
Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 610786 | |
beta-actin primary antibody (mouse monoclonal | Sigma | A5441 | |
HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody | Santa Cruz | sc-2031 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
Instrument | Company | Rotor/ model no | |
Benchtop Ultracentrifuge Optima Max | Beckman | MLA-80 | |
Sonicator | Heat Systems | XL20-20 | |
Homogeniser | Jenke and Kunkel | TP18/10 |