Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

Summary

Die Kleinhirn externen Körnerschicht ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn. Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Veränderung, die diese Schicht an der Spitze der Proliferation unter Verwendung ex vivo Elektroporation und Kultur zerebelläre Scheiben aus embryonalen Tag 14 Hühnerembryonen zu zielen.

Abstract

Die Kleinhirn externen Körnerschicht (EGL) ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn, und ein hervorragendes Modell für neuronale Proliferation und Differenzierung des Studiums. Darüber hinaus evolutionären Modifikationen ihrer Proliferationsfähigkeit wurden für die dramatische Ausweitung der Kleinhirngröße in den Amnioten verantwortlich, so dass das Kleinhirn ein hervorragendes Modell für Evo-Devo-Studien des Wirbeltiergehirns. Die konstituierenden Zellen der EGL, Kleinhirn-Körnervorläuferzellen, auch einen signifikanten Zellherkunfts stellen für Medulloblastom, die am häufigsten pädiatrischen neuronalen Tumor. Nach dem Transit-Amplifikation, Granulat Vorstufen migrieren radial in die innere Körnerschicht des Kleinhirns, wo sie den größten neuronalen Population im reifen Gehirn von Säugetieren dar. In chick, der Höhepunkt der EGL Proliferation tritt gegen Ende der zweiten Woche der Schwangerschaft. Um genetische Veränderung auf diese Schicht bei Targetder Peak der Proliferation, haben wir ein Verfahren zur genetischen Manipulation durch ex vivo-Elektroporation von Cerebellum Scheiben aus embryonalen Tag 14 Kükenembryos entwickelt. Dieses Verfahren faßt einige wichtige Aspekte der in vivo Granulatneuronenentwicklung und ist nützlich bei der Erzeugung ein gründliches Verständnis der Kleinhirn-Körnerzellproliferation und -differenzierung sein, und damit der Kleinhirn-Entwicklung, Evolution und Krankheit.

Introduction

Das Kleinhirn sitzt am vorderen Ende der Hinterhirn und ist für die Integration von sensorischen und motorischen Verarbeitung im reifen Gehirn verantwortlich sowie die Regelung höhere kognitive Prozesse ^1. In Säugetieren und Vögeln, eine aufwendige Morphologie besitzt sie und ist stark blättrigen, ein Produkt der umfangreichen Transit Amplifikation von Vorläuferzellen während der Entwicklung, die mehr als die Hälfte der Nervenzellen im erwachsenen Gehirn produziert. Das Kleinhirn ist für Neurobiologen seit Jahrhunderten und in der molekularen Ära ein Thema der Studie hat ebenfalls erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. Dies bezieht sich nicht nur auf ihre inhärent interessante Biologie, sondern auch auf die Tatsache, dass es stark in menschlichen Erkrankungen einschließlich Entwicklungs genetische Störungen wie Autismus ^{2 und} am deutlichsten Kleinhirnkrebs, Medulloblastom ^{3, die} die häufigste pädiatrische Gehirn beteiligt ist Tumor. Wichtig ist, dass es ein ausgezeichnetes Modellsystem im which dem Schicksal Allokation und Neurogenese während der Gehirnentwicklung ⁴ studieren. In den letzten Jahren hat es sich auch als Modellsystem für die vergleichende Untersuchung der Entwicklung des Gehirns festgestellt wurde, auf Grund der großen Vielfalt von Formen für die Kleinhirnwirbel phylogeny ^5-10 ersichtlich.

Das Kleinhirn entwickelt sich von der dorsalen Hälfte Rhombomer 1 im Hinterhirn ^{11 und} entwicklungs besteht aus zwei primären Vorläuferpopulationen, die Rautenlippe und der ventrikulären Zone zusammen. Die rhombische Lippe erstreckt sich um den dorsalen Bereich des Neuroepithels des Rautenhirns an der Grenze mit dem Dachblech. Es ist der Geburtsort der glutamatergen erregenden Neuronen des Kleinhirns ^12-14. Die ventrikuläre Zone führt zu den inhibitorischen GABAergen Neuronen des Kleinhirns, allen voran die großen Purkinje Neuronen ^14,15. Später in der Entwicklung (von etwa embryonalen Tag 13,5 in Maus; e6 in chick ^16), glutamatergen PROGENitors tangential wandern von der Rautenlippe und bilden eine Schicht der Pia-Vorläuferzellen: eine sekundäre Vorläuferzone genannt externen Körnerschicht (EGL). Es ist diese Schicht, die den umfangreichen Transit Verstärkung, die auf die große Zahl von Körnerzellen im reifen Gehirns führt erfährt.

Proliferation im EGL seit langem zum Teil pial Platz, in tangentiale Migration vom rhombischen ^Lippe 17 führt in Verbindung gebracht worden, wobei der Schalter auf den Zellzyklus verlassen und die neuronale Differenzierung von Vorläufern mit ihrem Austritt aus dem Außen EGL Schicht in der Mitte zugehörigen EGL ^18. Umfangreiche tangentiale Migration von postmitotischen Körnerzellen im medial-laterale Achse erfolgt in der mittleren und inneren EGL ^19, vor dem abschließenden radialen Wanderung in die innere Körnerschicht des reifen Kleinhirnrinde. Migration von Zellen aus dem rhombischen Lippe über der Kleinfläche abhängt CXCL12 Signalisierung vom pia ^20-22 </sup> Und Körnerzellen exprimieren das CXCL12-Rezeptor CXCR4. Ihre tangentiale Migration ist somit erinnert an die des Neokortex tangential Migration hemmenden Intern Bevölkerung ^23-25. Interessanterweise elektronenmikroskopischen Untersuchungen ¹⁷ haben vorgeschlagen, dass die EGL-Zellen mit einer proliferativen Morphologie beizubehalten Pia-Kontakt, die Verknüpfung Zellverhalten mit proliferative Fähigkeit in einer Art und Weise erinnert an die basalen Vorläuferzellen der Säugetier Cortex ^26. Dies wird in der vorgenannten Schichtung der EGL in drei Unterschichten, die durch verschiedene extrazelluläre Umgebungen und wo Körnchen Vorstufen haben verschiedene Genexpressions ¹⁸ definiert sind, reflektiert wird.

Proliferation von Vorläufern im oEGL tritt mit einer Normalverteilung von Klon Größen, so dass zu einem Medianwert von 250-500 g postmitotischen wenn Progenitoren einzeln genetisch am Ende der Embryonalentwicklung der Maus markiert, sie gebenranule Neuronen ^27,28. Proliferation ist abhängig von mitogenen SHH-Signalisierung von der zugrunde liegenden Purkinje Neuronen ^29-32. Die Fähigkeit, auf Shh antworten hat sich gezeigt, völlig abhängig von zellautonomen Expression des Transkriptionsfaktors Atoh1 zu sein, sowohl in vitro als auch in vivo ^{33 34,35.} Ebenso Zellzyklus verlassen und Differenzierung wurde gezeigt, abhängig von der Expression des Downstream-Transkriptionsfaktor NeuroD1 ^36, die wahrscheinlich eine direkte Repressor Atoh1 ³⁷ sein.

Trotz dieser Fortschritte und erheblichen Fortschritt in der Entzifferung der zellbiologischen Grundlagen der Zellzyklus-Ausgang ^38-42, die grundlegende molekulare Mechanismus (n), die die Entscheidung zugrunde liegen, die den Zellzyklus zu verlassen und von einem Stammvater zu einem differenzierenden Neuronen übergehen, und die assoziierten postmitotischen tangentiale Migration im inneren EGL sowie die später Schalterum die radiale Migration, bleiben unvollständig verstanden. Dies ist zu einem großen Teil aufgrund der experimentellen intractability der EGL: es spät entwickelnden und genetisch schwer gezielt da viele der neurogenen Moleküle sind auch entscheidend früher im Leben der Granulat Vorstufen am rhombischen Lippe. Um dieses Problem zu überwinden, wurden zahlreiche Autoren in vivo und ex vivo Elektroporation als eine Methode, um die postnatale Kleinhirn bei Nagern ^43-48 Ziel entwickelt. Hier haben wir Pionierarbeit in der Verwendung von ex vivo Elektroporation in Küken, die EGL, die erhebliche Vorteile in Bezug auf Kosten und Bequemlichkeit stellt studieren. Unsere Methode der Elektroporation und ex vivo Schnittkultur von Chick Kleinhirngewebe verwendet Gewebe aus embryonalen Tag seziert 14 Küken auf dem Höhepunkt der EGL Verbreitung. Diese Methode ermöglicht es genetische Targeting des EGL unabhängig rhombischen Lippe und die Bühne für Genetik der Übergang vom Granulat eingestelltVorläufer zu postmitotischen Granulat Neuronen im Kleinhirn.

Protocol

Hinweis: Alle Experimente wurden mit entsprechend den Kings College London, Großbritannien und die britische Innenministerium Tierpflege-Richtlinien durchgeführt. 1. Präparation der e14 Cerebellum Braun befruchteten Hühnereiern Inkubation bei 38 ° C zu embryonalen Tag 14. Mit Ei Schere enthaupten Hühnerembryo in ovo, und entfernen Sie den Kopf auf eine Petrischale mit eiskaltem PBS (Abbildung 1A). Verwendung von Standard-Pinzette…

Representative Results

Dieser Abschnitt zeigt Beispiele von Ergebnissen, die unter Verwendung von Scheiben Elektroporation und die Kultur des Kleinhirns aus embryonalen Tag 14 Küken gewonnen werden können. Die Präparation des Kleinhirns ist in Abbildung 1 veranschaulicht und die Elektroporationskammer einzurichten ist in Abbildung 2 dargestellt. Wir zeigen, dass es möglich ist, Kultur Kleinhirnschnitten, die ihre Struktur und Zellmorphologie in vitro</…

Discussion

Das Protokoll hier berichteten beschreibt ein Verfahren zum Präparieren, Elektroporation und Kultivieren Scheiben embryonalen Tag 14 Kleinhirn von der Küken. Dieses Protokoll ermöglicht Targeting der Elektroporation zur kleinen Brenn Regionen der EGL, einschließlich isolierten Ausrichtung der einzelnen Kleinhirnlappen. Es ermöglicht die genetische Analyse und Bildgebung mit einer hohen Auflösung und Bequemlichkeit, und zu geringen Kosten im Vergleich zu etablierten Techniken in Nagetieren ^43-47. Eine so…

Materials

McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicillin/streptomycin	Sigma	P4333
0.4μm culture insert	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.