Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em> In Vivo</em
Summary
Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.
Abstract
Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.
Introduction
De laatste jaren uiteenlopende genetische, moleculaire en genomische instrumenten ontwikkeld in het model species Arabidopsis thaliana. Deze technologie is enorm vergemakkelijkt de vooruitgang in het begrijpen van hoe de ontwikkeling van de plant wordt geregeld. Onder de ontwikkelingsprocessen bestudeerd met behulp van Arabidopsis als een model, heeft de genetische controle van de bloeitijd is uitvoerig geanalyseerd. Deze studies hebben aangetoond dat planten moduleren zeer nauwkeurig het tijdstip van bloei in reactie op endogene signalen zoals hormonen en de leeftijd van de plant, en ook voor het milieu signalen zoals fotoperiode en temperatuur die synchroniseren bloeitijd met de natuurlijke cyclus van de seizoenen 1, 2. De isolatie en karakterisering van Arabidopsis mutanten met veranderingen in de tijd van de bloei is in de onthulling van een complex netwerk van genen die de bloeitijd te regelen in reactie op endogene en omgevingsfactoren bepalend geweest. Deze genetische circuitsgeïntegreerd op het niveau van een paar meester genen die fungeren als schakelaars van de bloei, en de exacte timing van de bloemen initiatie is afhankelijk van het saldo van de bloei bevorderen en het onderdrukken van activiteiten die stroomopwaarts van de bloemen integrator genen 1,3 werken.
De functionele karakterisering van genen die voor hun rol in de controle van de bloei initiatie, geholpen door het recente gebruik van genomische benaderingen gebleken de centrale rol van transcriptionele regulatie bij de modulering van de bloeitijd. In feite zijn veel van de meester genen bloeiende coderen transcriptiefactoren 4. Daarnaast is een aantal chromatine hermodellering eiwitcomplexen invloed op de expressie van genen meester van de bloei. Een aantal van de Arabidopsis mutanten die veranderde hun bloeitijd bleek mutaties in genen die coderen voor verschillende chromatine modifiers dragen. Verschillende chromatine remodelers die posttranslationele modificaties in histon introducerene staarten, herpositioneren nucleosomen ten opzichte van het DNA of wisselen canonieke histonen door histone varianten nodig voor de goede regulering van de bloei in Arabidopsis 5,6. Sommige chromatine hermodellering activiteiten katalyseren de afzetting of verwijdering van covalente modificaties zoals acetylering of methylatie specifieke histon residuen. Deze histon markeringen worden specifiek herkend door gespecialiseerde effectoren dat andere chromatine remodeling complexen, transcriptiefactoren of onderdelen van de transcriptie machinerie te werven om de transcriptionele activiteit van bloeiende genen reguleren.
Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) mogelijk maken om in vivo DNA-bindingsplaatsen voor eiwitten van belang (figuur 1). Deze procedure maakt gebruik van het vermogen van bepaalde chemische stoffen te verknopen de eiwitten aan het DNA. De resulterende DNA-eiwitcomplexen kan vervolgens worden geïmmunoprecipiteerd met specifieke antilichamen against transcriptiefactoren, chromatine-bindende eiwitten, of specifieke modificaties en heterologe epitopen (gewoonlijk aangeduid als "markeringen") bevestigd aan het eiwit van keuze. Het DNA gezuiverd uit deze immunologische neerslagen kunnen worden gebruikt als een matrijs in kwantitatieve PCR (qPCR) reacties beoordelen voor verrijking van specifieke sequenties van belang. Zo kunnen de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren of de verdeling van histon merken bepaalde genen worden vastgesteld 7,8. Bovendien, in combinatie met Next Generation Sequencing (NGS) dat massieve parallelle sequentiebepaling mogelijk maakt chiptechnologie is mogelijk genoom-brede identificatie van de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren en onthulling epigenomisch landschappen van histon wijzigingen. Verder is de gelijktijdige analyse van genexpressie voor het bewaken hoe de binding van transcriptiefactoren of de depositie van specifieke histon markeringen gecorreleerd met transcriptionele activity van genen 9.
Het gebruik van ChIP protocollen Arabidopsis is toegestaan evaluatie van het effect dat verschillende transcriptionele regulatoren hebben voor de organisatie van de chromatinestructuur meester genen van bloei en hoe deze structurele veranderingen beïnvloeden genexpressie 5,6. Eerdere resultaten toonden aan dat de Arabidopsis locus EARLY builen IN korte dagen (EBS) fungeert als een repressor van bloei en mutanten in dit gen tonen een versnelling van bloei en opregulatie van de meester-gen van de bloei FT. Verder verlies-van-functie mutaties in FT volledig onderdrukken van de vroege bloei fenotype van de EBS mutante planten, wat aangeeft dat FT nodig is voor de voortijdige ontplooiing van EBS mutanten en dat EBS is voor de onderdrukking van deze meester gen van de bloei 10 , 11. EBS codeert voor een PHD-bevattend eiwit dat specifiek kan binden histon H3 di- en trigemethyleerd in the 4 lysine residu (H3K4me2 / 3), suggereert een rol voor EBS in de chromatine-gemedieerde repressie van FT 12. Het gebruik van de ChIP aanpak aangetoond dat de Arabidopsis-PHD bevattend eiwit EBS 10,11 bindt regulerende gebieden van de florale integrator gen FT haar uitspraken 12 onderdrukken. Aanvullende gegevens verkregen door toepassing van chiptechnologie toonde aan dat dit eiwit vereist is om lage niveaus van histone acetylering, een kenmerk van actieve transcriptie in het chromatine van deze meester gen van bloeiende behouden tijdens de initiële stadia van ontwikkeling Arabidopsis. Deze waarnemingen tezamen met genetische en genexpressie data aantonen dat Arabidopsis PHD-bevattende eiwit een centrale rol in de fijnafstelling van bloeitijd door het moduleren van de expressie van het gen floral integrator 12 FT. De hier gepresenteerde werk geeft een geoptimaliseerde werkwijze niet alleen bruikbaar voor de analyse van histonen, maar ook voor anderechromatine-geassocieerde eiwitten, en met een verhoogde efficiëntie en minder experimenteel tijd. Voorts is dit verslag illustreert hoe het gebruik van ChIP protocols nieuwe inzichten voorziet in de relatie tussen veranderingen in chromatine modificaties en transcriptionele toestanden van plantengenen, en hoe deze chromatine-gemedieerde controlemechanismen effect genexpressie op het begin van de bloei in Arabidopsis.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ChIP protocol beschreven is een reproduceerbare en krachtige techniek interacties tussen eiwitten en specifieke DNA-sequenties in vivo analyse in Arabidopsis planten. Een succesvolle identificatie van bindingsplaatsen voor de eiwitten van belang vereist een adequate selectie van plantaardige organen of ontwikkelingsstadia waar de relevante interacties daadwerkelijk plaatsvinden. Bovendien is het essentieel om de juiste fixatie van het plantenmateriaal en een optimale afschuiving van het chromatine door sonic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Economìa y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).
Materials
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack – DynaMag™-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex® 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler® 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
Referências
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
