Immunoprécipitation de la chromatine test pour l'identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN<em> In Vivo</em
Summary
Immunoprécipitation de la chromatine est une technique puissante pour l'identification des sites d'ADN d'Arabidopsis protéines de liaison in vivo. Cette procédure comprend la réticulation de la chromatine et la fragmentation, une immunoprécipitation avec des anticorps sélectifs contre la protéine d'intérêt, et l'analyse qPCR de l'ADN lié. Nous décrivons un test simple de ChIP optimisé pour les plantes d'Arabidopsis.
Abstract
Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.
Introduction
Au cours des dernières années, un large éventail d'outils génétiques, moléculaires et génomiques ont été développés dans le espèce modèle Arabidopsis thaliana. Cette technologie a facilité énormément le progrès dans la compréhension comment le développement de la plante est réglementé. Parmi les processus développementaux étudiés en utilisant Arabidopsis comme un modèle, le contrôle génétique de la période de floraison a été largement analysé. Ces études ont montré que les plantes modulent très précisément le moment de la floraison, en réponse à des signaux endogènes tels que les hormones et l'âge de la plante, et également à des signaux environnementaux tels que la photopériode et la température qui synchronisent floraison avec le cycle naturel des saisons 1, 2. L'isolement et la caractérisation de mutants d'Arabidopsis avec des altérations dans le temps de la floraison a été déterminant pour dévoiler un réseau complexe de gènes qui régulent la période de floraison, en réponse à des facteurs endogènes et environnementaux. Ces circuits sont génétiquesintégré au niveau de quelques gènes maîtres qui agissent comme des interrupteurs de la floraison, et le moment exact de l'initiation florale dépend de l'équilibre de la floraison et de la promotion de réprimer les activités qui travaillent en amont des gènes intégrateurs floraux 1,3.
La caractérisation fonctionnelle des gènes identifiés pour leur rôle dans le contrôle de la floraison initiation, aidé par l'utilisation récente des approches génomiques, ont révélé le rôle central de la régulation transcriptionnelle dans la modulation du temps de la floraison. En fait, la plupart des gènes maîtres de floraison encodage facteurs de transcription 4. En outre, un certain nombre de complexes de protéines de remodelage de la chromatine influence l'expression des gènes de base de la floraison. Un certain nombre de mutants d'Arabidopsis isolés pour leur temps de floraison altérée avéré porteurs de mutations dans les gènes codant pour une variété de modificateurs de la chromatine. Rénovateurs de la chromatine différents qui introduisent modifications post-traductionnelles dans histone queues, repositionner nucléosomes par rapport à l'ADN ou des histones canoniques échangent par des variantes des histones sont nécessaires à la bonne régulation de la floraison chez Arabidopsis 5,6. Certaines de ces activités de remodelage de la chromatine catalyser le dépôt ou le retrait des modifications covalentes telles que l'acétylation ou méthylation des histones dans les résidus spécifiques. Ces marques des histones sont spécifiquement reconnus par des effecteurs spécialisées qui recrutent d'autres complexes de remodelage de la chromatine, des facteurs de transcription ou des composants de la machinerie transcriptionnelle de réguler l'activité transcriptionnelle des gènes de floraison.
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) permet l'identification de l'ADN in vivo sites de liaison pour des protéines d'intérêt (Figure 1). Cette procédure tire parti de la capacité de certains produits chimiques pour réticuler les protéines à l'ADN. Les complexes de protéines-ADN résultants peuvent être ensuite immunoprécipitées en utilisant des anticorps spécifiques against facteurs de transcription, des protéines de liaison à la chromatine, ou des modifications particulières et des epitopes hétérologues (communément appelés "tags") fixés à la protéine de choix. L'ADN purifié à partir de ces immunoprécipités peut être utilisé comme un modèle dans quantitatives réactions PCR (qPCR) pour évaluer l'enrichissement des séquences particulières d'intérêt. De cette manière, les sites de liaison de facteurs de transcription ou la distribution des marques d'histone dans des gènes particuliers peuvent être établis 7,8. En outre, combiné avec Next Generation Sequencing (NGS) qui permet le séquençage massivement parallèle, la technologie des puces a rendu possible l'identification du génome entier des sites de liaison de facteurs de transcription ainsi que des paysages épigénomiques dévoilement de modifications des histones. En outre, l'analyse simultanée de l'expression génique permet de surveiller la façon dont la liaison des régulateurs de transcription ou le dépôt de marques particulières des histones en corrélation avec la transcription activity 9 de gènes.
L'utilisation de protocoles de puce dans Arabidopsis a permis d'évaluer l'impact d'une variété de régulateurs de transcription sur l'organisation de la chromatine des gènes maîtres de la floraison et de la façon dont ces changements structurels influent sur l'expression des gènes 5,6. Résultats précédents ont montré que le locus Arabidopsis BOLTING TOT EN JOURS COURTS (EBS) agit comme un répresseur de la floraison et les mutants dans ce spectacle de gène d'une accélération de la floraison et la régulation positive du gène maître de la floraison FT. En outre, les mutations de perte de fonction dans FT suppriment complètement la floraison phénotype précoce des plantes ebs de mutants, indiquant que FT est nécessaire pour la floraison prématurée des mutants ebs et que EBS est nécessaire à la répression de ce gène maître de la floraison 10 , 11. EBS code pour une protéine contenant PHD qui peuvent se lier spécifiquement histone H3 di- et triméthylée en the lysine 4 résidus (H3K4me2 / 3), ce qui suggère un rôle pour EBS dans la répression de la chromatine médiée par FT 12. L'utilisation de l'approche de ChIP démontré que l'Arabidopsis contenant PHD-protéine EBS 10,11 lie régions régulatrices du gène FT intégrateur floral pour réprimer son expression 12. Des données supplémentaires obtenues grâce à l'utilisation de la technologie à puce ont montré que cette protéine est nécessaire pour maintenir de faibles niveaux de l'acétylation des histones, une caractéristique de la transcription active, dans la chromatine de ce gène maître de la floraison au cours des étapes initiales du développement d'Arabidopsis. Ces observations, ainsi que des données d'expression génétique et le gène, démontrer que cette PHD-contenant des protéines d'Arabidopsis a un rôle central dans le réglage fin de la période de floraison en modulant l'expression du gène de l'intégrateur floral FT 12. Le travail présenté ici fournit un procédé optimisé utile non seulement pour l'analyse des histones, mais aussi pour d'autreschromatine des protéines associées, et avec une efficacité accrue et une réduction du temps expérimental. En outre, ce rapport illustre comment l'utilisation de protocoles de puce a fourni de nouvelles informations sur la relation entre les changements de modifications de la chromatine et les états de la transcription de gènes de plantes, et comment ces mécanismes de l'impact du contrôle de l'expression du gène de la chromatine médiation sur le début de la floraison chez Arabidopsis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ci-ChIP est une technique reproductible et puissant pour analyser les interactions entre les protéines et les séquences d'ADN spécifiques in vivo dans des plantes Arabidopsis. Une identification réussie des sites de liaison pour les protéines d'intérêt exige une sélection adéquate des organes de la plante ou des stades de développement où les interactions pertinentes ont effectivement lieu. En outre, il est essentiel d'obtenir une fixation appropriée de la matière v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Economìa y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).
Materials
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack – DynaMag™-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex® 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler® 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
Referências
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