immunoprecipitation הכרומטין הוא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי DNA מחייבת אתרים של חלבוני ארבידופסיס in vivo. הליך זה כולל הכרומטין המקשר בין-ופיצול, immunoprecipitation עם נוגדנים נגד סלקטיבית החלבון של עניין, וניתוח qPCR של DNA הקשור. אנו מתארים assay שבב פשוט מותאם לצמחי ארבידופסיס.
Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.
בשנים האחרונות מגוון רחב של כלים גנטיים, מולקולריים והגנומי פותחו בthaliana ארבידופסיס מיני מודל. טכנולוגיה זו יש להקל מאוד את ההתקדמות בהבנה כיצד התפתחות צמח מוסדרת. בין התהליכים התפתחותיים למדו באמצעות ארבידופסיס כמודל, הבקרה הגנטית של זמן פריחה כבר נותחה בהרחבה. מחקרים אלה הראו כי צמחים לווסת בדיוק מאוד הזמן של פריחה בתגובה לרמזים אנדוגני כגון הורמונים והגיל של הצמח, וגם לאותות סביבתיים כגון photoperiod וטמפרטורה לסנכרן פריחת זמן עם מחזור הטבעי של עונות 1, 2. הבידוד והאפיון של מוטציות ארבידופסיס עם שינויים בזמן של פריחה היה הקובע בחשיפת רשת מורכבת של גנים המווסתים את זמן הפריחה בתגובה לגורמי אנדוגני והסביבתיים. מעגלים הגנטיים אלהמשולב ברמה של כמה גני הורים הפועלים כמתגים של פריחה, והעיתוי של הייזום הפרחוני המדויק תלוי באיזון של פריחת קידום ומדחיק את פעילות שעובדות במעלה הזרם של גני אינטגרטור הפרחוני 1,3.
האפיון הפונקציונלי של הגנים שזוהו על תפקידם בשליטה של ייזום פריחה, נעזר בשימוש האחרון של גישות הגנומי, חשפו את התפקיד המרכזי של רגולציה תעתיק באפנון של זמן פריחה. למעשה, רבים מהגנים ההורים של שעתוק לקודד פריחת גורמי 4. בנוסף, מספר מתחמי חלבון שיפוץ הכרומטין להשפיע על הביטוי של גני הורים של פריחה. מספר מוטציות ארבידופסיס המבודדים לזמן הפריחה שינה התברר לשאת מוטציות בגני מקודדי מגוון של מכפילי הכרומטין. remodelers הכרומטין שונה שמציג את השינויים בposttranslational Histonדואר זנבות, למקם nucleosomes ביחס ל- DNA או להחליף ההיסטונים הקנונית על ידי גרסאות היסטון נחוצים לוויסות הנכונה של הפריחה בארבידופסיס 5,6. חלק מפעילויות שיפוץ הכרומטין אלה לזרז את התצהיר או הסרת שינויים קוולנטיים כגון acetylation או מתילציה בשאריות היסטון ספציפיות. סימני היסטון אלה מוכרים במיוחד על ידי effectors מיוחדת שמגייסות מתחמים אחרים שיפוץ הכרומטין, גורמי שעתוק או רכיבים של מכונות תעתיק להסדיר את פעילות תעתיק של גנים פורחים.
הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מאפשר זיהוי של in vivo אתרים לחלבונים של עניין מחייב DNA (איור 1). הליך זה מנצל את היכולת של כימיקלים מסוימים לקישור צולב חלבונים לדנ"א. מתחמי DNA החלבון וכתוצאה מכך ניתן immunoprecipitated אז באמצעות אגא נוגדנים הספציפיגורמי שעתוק Inst, מחייב חלבוני הכרומטין, או שינויים מסוימים וepitopes Heterologous (המכונים "תגים" בדרך כלל) שצורפו לחלבון של בחירה. ה- DNA מטוהר מimmunoprecipitates אלה יכול לשמש כתבנית בתגובות PCR (qPCR) כדי להעריך להעשרה של רצפים מסוימים של עניין. בדרך זו, ניתן להקים אתרי הקישור של גורמי שעתוק או ההפצה של סימני היסטון בגנים מסוימים 7,8. בנוסף, בשילוב עם הדור הבא רצף (NGS) המאפשר רצף מקביל מאסיבי, טכנולוגיית שבבים הפכה אפשרית זיהוי הגנום של אתרי הקישור של גורמי שעתוק כמו גם נופי epigenomic הסרת לוט משינויי היסטון. יתר על כן, הניתוח בו זמני של ביטוי גנים מאפשר ניטור איך המחייב של רגולטורי תעתיק או התצהיר של סימני היסטון מסוימים לתאם עם תעתיק פעילויותיוty של גנים 9.
השימוש בפרוטוקולי שבב בארבידופסיס אפשר להעריך את ההשפעה שמגוון של רגולטורי תעתיק יש בארגון הכרומטין של גני הורים של פריחה וכיצד שינויים המבניים אלה משפיעים על ביטוי גני 5,6. תוצאות קודמות הראו כי הנעילה מוקד ארבידופסיס מוקדם בימים קצרים (EBS) פועלת כמדכאת של פריחה ומוטציות בגן זה מופע ההאצה של פריחה וגברת ביטוי של גן ההורים של FT פריחה. בנוסף, מוטציות פסד של הפונקציה בFT לדכא באופן מלא את הפנוטיפ הפריחה המוקדם של הצמחים מוטנטים EBS, המצביע על כך FT דרוש לפריחה המוקדמת של מוטציות EBS ושEBS הוא הכרחי לדיכוי של גן הורים זה של פריחת 10 , 11. EBS מקודד חלבון המכיל PHD שיכול להיקשר באופן ספציפי di- היסטון H3 וtrimethylated בהליזין דואר 4 שאריות (H3K4me2 / 3), המצביעות על תפקיד לEBS בדיכוי בתיווך הכרומטין של 12 FT. השימוש בגישת השבב הוכיח כי EBS החלבון המכיל PHD ארבידופסיס 10,11 נקשר אזורי רגולציה של FT גן אינטגרטור הפרחוני להדחיק ביטויה 12. נתונים נוספים שהושגו באמצעות השימוש בטכנולוגיית השבבים הראו כי נדרש חלבון זה כדי לשמור על רמות נמוכות של acetylation היסטון, סימן היכר של שעתוק פעיל, בהכרומטין של גן הורים זה של פריחה בשלבים ראשוניים של פיתוח ארבידופסיס. תצפיות אלה, יחד עם נתונים ביטוי גנטי וגן, להוכיח שיש חלבון זה ארבידופסיס PHD המכיל תפקיד מרכזי בכוונון העדין של זמן פריחה על ידי ויסות הביטוי של גן אינטגרטור הפרחוני 12 FT. העבודה המוצגת כאן מספקת שיטה מותאמת שימושית לא רק לניתוח של ההיסטונים אלא גם לאחריםהכרומטין קשורים חלבונים, ועם התייעלות וצמצום זמן ניסוי. יתר על כן, דו"ח זה מדגים כיצד השימוש בפרוטוקולי שבב סיפק תובנות חדשות את הקשר בין שינויים בשינויי הכרומטין ומדינות תעתיק של גני צמח, וכיצד מנגנונים אלה בתיווך הכרומטין של השפעת שליטת ביטוי גנים בתחילת הפריחה בארבידופסיס.
פרוטוקול השבב המתואר כאן הוא טכניקה לשחזור ורבה עוצמה כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים ורצפי DNA ספציפיים in vivo בצמחי ארבידופסיס. זיהוי מוצלח של אתרי קישור לחלבונים של עניין מחייב בחירה נאותה של איברי צמח או שלבי התפתחות שבו האינטראקציות הרלוונטיות למעשה מתרחשות…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Economìa y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).
MES | Sigma | M8250 | |
MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
Glycine | Sigma | 50046 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
(mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
Magnetic rack – DynaMag™-2 | Life Technologies | 12321D | |
H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
Chelex® 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
LightCycler® 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |