एराबिडोप्सिस प्रोटीन डीएनए बातचीत की पहचान के लिए chromatin immunoprecipitation परख<em> Vivo</em
Summary
Chromatin immunoprecipitation डीएनए विवो में एराबिडोप्सिस प्रोटीन के बाध्यकारी साइटों की पहचान के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। यह प्रक्रिया क्रोमेटिन पार से जोड़ने और विखंडन, ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ चयनात्मक एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitation, और बाध्य डीएनए की qPCR विश्लेषण भी शामिल है। हम Arabidopsis पौधों के लिए अनुकूलित एक सरल चिप परख का वर्णन है।
Abstract
Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.
Introduction
हाल के वर्षों के दौरान, आनुवंशिक आणविक और जीनोमिक उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला के मॉडल प्रजातियों Arabidopsis thaliana में विकसित किया गया है। यह तकनीक संयंत्र विकास नियंत्रित किया जाता है कैसे को समझने में काफी प्रगति की है। एक मॉडल के रूप में एराबिडोप्सिस का उपयोग कर अध्ययन में विकास की प्रक्रिया के अलावा, फूल समय के आनुवंशिक नियंत्रण बड़े पैमाने पर विश्लेषण किया गया है। इन अध्ययनों से पौधों ऐसे हार्मोन और संयंत्र की उम्र के रूप में अंतर्जात संकेतों के जवाब में फूल की बहुत ठीक समय मिलाना पता चला है कि, और यह भी 1 मौसम के प्राकृतिक चक्र के साथ समय फूल सिंक्रनाइज़ ऐसे फोटो पीरियड और तापमान के रूप में पर्यावरण के संकेतों को, 2। फूल के समय में परिवर्तन के साथ एराबिडोप्सिस म्यूटेंट के अलगाव और लक्षण अंतर्जात और पर्यावरणीय कारकों के जवाब में फूल समय को नियंत्रित करने वाले जीन की एक जटिल नेटवर्क के अनावरण में निर्धारक किया गया है। ये आनुवंशिक सर्किट रहे हैंफूल के स्विच के रूप में काम करते हैं कि कुछ मास्टर जीन के स्तर पर एकीकृत, और फूलों की दीक्षा का सही समय फूल को बढ़ावा देने और पुष्प करनेवाला जीन 1,3 के अपस्ट्रीम है कि काम की गतिविधियों के दमन के संतुलन पर निर्भर करता है।
जीनोमिक दृष्टिकोण के हाल के उपयोग द्वारा सहायता प्राप्त फूल दीक्षा के नियंत्रण में उनकी भूमिका के लिए पहचान की जीन के कार्यात्मक विशेषताओं, फूल समय के मॉडुलन में ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की केंद्रीय भूमिका को उजागर किया है। वास्तव में, फूल सांकेतिक शब्दों में बदलना प्रतिलेखन के मास्टर जीन की कई 4 कारकों। इसके अलावा, क्रोमेटिन पुर्ननिर्माण प्रोटीन परिसरों में से एक नंबर फूल के मास्टर जीनों की अभिव्यक्ति को प्रभावित करती है। उनकी बदल फूल समय के लिए पृथक एराबिडोप्सिस म्यूटेंट के एक नंबर क्रोमेटिन संशोधक की एक किस्म एन्कोडिंग जीन में म्यूटेशन ले जाने के लिए निकला। Histon में posttranslational संशोधनों से शुरू होने वाले विभिन्न क्रोमेटिन remodelersई पूंछ, डीएनए के सापेक्ष nucleosomes स्थान या एराबिडोप्सिस 5,6 में फूल का उचित नियमन के लिए हिस्टोन वेरिएंट द्वारा आवश्यक विहित histones रहे हैं विनिमय। इन क्रोमेटिन पुनर्गठन गतिविधियों के कुछ बयान या ऐसे विशिष्ट हिस्टोन अवशेषों में एसिटिलीकरण या मिथाइलेशन के रूप में सहसंयोजक संशोधनों को हटाने के लिए उत्प्रेरित। ये हिस्टोन के निशान विशेष रूप से फूल जीन के गतिविधि को विनियमित करने के लिए अन्य क्रोमेटिन remodeling के परिसरों, प्रतिलेखन कारक या ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी के घटकों की भर्ती कि विशेष प्रभावोत्पादक द्वारा मान्यता प्राप्त हैं।
Chromatin immunoprecipitation (चिप) में विवो डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के हित के लिए साइटों (चित्रा 1) की पहचान की अनुमति देता। इस प्रक्रिया के डीएनए के लिए पार से लिंक करने के लिए कुछ रसायनों की क्षमता की वजह से प्रोटीन लाभ लेता है। जिसके परिणामस्वरूप डीएनए प्रोटीन परिसरों तो विशिष्ट एंटीबॉडी आगा का उपयोग करके immunoprecipitated किया जा सकताइंस्ट प्रतिलेखन कारक है, क्रोमेटिन बाध्यकारी प्रोटीन, या विशेष संशोधनों और heterologous एपिटोप्स पसंद के प्रोटीन से जुड़ी (आमतौर पर "टैग" के रूप में करने के लिए कहा गया है)। इन immunoprecipitates से शुद्ध डीएनए ब्याज की विशेष दृश्यों के संवर्धन के लिए आकलन करने के लिए मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) प्रतिक्रियाओं में एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह, प्रतिलेखन कारक के बंधन साइटों या विशेष जीन में हिस्टोन के निशान से वितरण 7.8 स्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण सक्षम बनाता है कि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) के साथ संयुक्त, चिप प्रौद्योगिकी प्रतिलेखन कारक के बाध्यकारी साइटों के साथ-साथ हिस्टोन संशोधनों के अनावरण Epigenomic परिदृश्य के जीनोम चौड़ा पहचान संभव बना दिया है। इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति का एक साथ विश्लेषण ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के बंधन या विशेष हिस्टोन के निशान के बयान ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधियों के साथ संबंध स्थापित कैसे निगरानी की अनुमति देता हैजीन 9 के ty।
एराबिडोप्सिस में चिप प्रोटोकॉल का उपयोग ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों की एक किस्म क्रोमेटिन फूल के मास्टर जीन के संगठन और कैसे इन संरचनात्मक परिवर्तन जीन अभिव्यक्ति 5,6 प्रभाव पर है कि प्रभाव का आकलन करने की अनुमति दी है। पिछले परिणाम ही दिनों में एराबिडोप्सिस ठिकाना जल्दी पेंच (ईबीएस) इस जीन शो में फूल और फूल एफटी के मास्टर जीन की अपरेगुलेशन की एक त्वरण फूल और म्यूटेंट के एक repressor के रूप में कार्य करता है कि पता चला है। इसके अलावा, एफटी में नुकसान के समारोह के म्यूटेशन को पूरी तरह से एफटी ईबीएस म्यूटेंट के समय से पहले फूल के लिए और ईबीएस 10 फूल के इस मास्टर जीन के दमन के लिए आवश्यक है कि आवश्यक है यह दर्शाता है कि ईबीएस उत्परिवर्ती पौधों की जल्दी फूल फेनोटाइप को दबाने 11। ईबीएस विशेष हिस्टोन H3 di- बाँध और वीं में trimethylated सकता है कि एक पीएचडी युक्त प्रोटीन को कूटबद्धएफटी 12 के क्रोमेटिन की मध्यस्थता दमन में ईबीएस के लिए एक भूमिका सुझाव ई लाइसिन 4 छाछ (/ 3 H3K4me2),। चिप दृष्टिकोण का उपयोग एराबिडोप्सिस पीएचडी युक्त प्रोटीन ईबीएस 10,11 अपनी अभिव्यक्ति 12 को दबाने के लिए पुष्प करनेवाला जीन एफटी की विनियामक क्षेत्रों कि बांध का प्रदर्शन किया। चिप प्रौद्योगिकी के उपयोग के माध्यम से प्राप्त अतिरिक्त डेटा इस प्रोटीन एराबिडोप्सिस विकास के प्रारंभिक चरण के दौरान फूल के इस मास्टर जीन की क्रोमेटिन में हिस्टोन एसिटिलीकरण, सक्रिय प्रतिलेखन की एक बानगी के निम्न स्तर को बनाए रखने के लिए आवश्यक है कि पता चला है। एक साथ आनुवंशिक और जीन अभिव्यक्ति डेटा के साथ इन टिप्पणियों, इस एराबिडोप्सिस पीएचडी युक्त प्रोटीन पुष्प करनेवाला जीन एफटी 12 की अभिव्यक्ति के नियमन से फूल समय के ठीक ट्यूनिंग में एक केंद्रीय भूमिका है कि प्रदर्शित करता है। यहां प्रस्तुत काम histones के विश्लेषण के लिए बल्कि अन्य के लिए न केवल उपयोगी एक अनुकूलित तरीका प्रदान करता हैक्रोमेटिन प्रोटीन जुड़े, और वृद्धि की दक्षता के साथ और प्रयोगात्मक समय कम कर दिया। इसके अलावा, इस रिपोर्ट चिप प्रोटोकॉल का उपयोग एराबिडोप्सिस में फूल की शुरुआत पर जीन अभिव्यक्ति पर नियंत्रण के प्रभाव के इन क्रोमेटिन की मध्यस्थता तंत्र क्रोमेटिन संशोधनों में परिवर्तन और संयंत्र जीन के राज्यों के बीच संबंधों में नए अंतर्दृष्टि प्रदान की है, और कैसे है कि कैसे दिखाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित चिप प्रोटोकॉल Arabidopsis पौधों में विवो में प्रोटीन और विशिष्ट डीएनए दृश्यों के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और शक्तिशाली तकनीक है। ब्याज की प्रोटीन क…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Economìa y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).
Materials
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack – DynaMag™-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex® 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler® 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
Referências
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