Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA<em> In Vivo</em
Summary
Cromatina immunoprecipitazione è una tecnica potente per l'identificazione di DNA siti di Arabidopsis proteine in vivo vincolante. Questa procedura include cromatina reticolazione e frammentazione, immunoprecipitazione con anticorpi selettivi contro la proteina di interesse, e l'analisi qPCR di DNA legato. Descriviamo un semplice saggio di ChIP ottimizzato per piante di Arabidopsis.
Abstract
Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.
Introduction
Negli ultimi anni una vasta gamma di strumenti genetici, molecolari e genomici sono stati sviluppati nella specie modello Arabidopsis thaliana. Questa tecnologia ha facilitato enormemente il progresso nella comprensione di come lo sviluppo della pianta è regolamentata. Tra i processi di sviluppo studiati utilizzando Arabidopsis come modello, il controllo genetico del tempo di fioritura è stata ampiamente analizzata. Questi studi hanno dimostrato che le piante modulano estrema precisione il tempo di fioritura in risposta a stimoli endogeni come ormoni e l'età della pianta, e anche a segnali ambientali come fotoperiodo e temperatura che sincronizzano tempo di fioritura con il ciclo naturale delle stagioni 1, 2. L'isolamento e la caratterizzazione di mutanti di Arabidopsis con alterazioni nel tempo della fioritura è stato determinante nello svelare una complessa rete di geni che regolano il tempo di fioritura in risposta a fattori endogeni ed ambientali. Questi circuiti sono geneticheintegrato a livello di alcuni geni master che agiscono come interruttori di fioritura, e l'esatta tempistica di apertura floreale dipende dall'equilibrio della fioritura e promuovere attività che lavorano a monte dei geni integratore floreali 1,3 reprimere.
La caratterizzazione funzionale dei geni identificati per il loro ruolo nel controllo di iniziazione fioritura, complice il recente uso di approcci genomici, hanno rivelato il ruolo centrale della regolazione trascrizionale nella modulazione del tempo di fioritura. In effetti, molti dei geni maestri codificano fattori di trascrizione fioritura 4. Inoltre, un certo numero di cromatina complessi proteici rimodellamento influenzano l'espressione dei geni maestri di fioritura. Un certo numero di mutanti di Arabidopsis isolati per il loro tempo di fioritura alterato rivelato trasportare mutazioni nei geni che codificano per una varietà di modificatori della cromatina. Diversi rimodellatori cromatina che introducono modificazioni post-a Histone code, riposizionare nucleosomi relativi al DNA o scambiano istoni canoniche da varianti istoni sono necessarie per la corretta regolazione della fioritura in Arabidopsis 5,6. Alcune di queste attività di rimodellamento della cromatina catalizzano la deposizione o la rimozione di modifiche covalenti quali acetilazione o metilazione in specifici residui istoni. Questi segni istoni sono specificamente riconosciuti da effettori specializzate che reclutano altri complessi di rimodellamento della cromatina, fattori di trascrizione o componenti del macchinario trascrizionale per regolare l'attività trascrizionale di geni fioritura.
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) permette di individuare in vivo DNA-binding siti per le proteine di interesse (Figura 1). Questa procedura sfrutta la capacità di alcune sostanze chimiche per reticolare le proteine al DNA. I risultanti complessi DNA-proteina possono essere poi immunoprecipitati utilizzando anticorpi specifici agafattori di trascrizione, proteine inst-cromatina legame, o particolari modifiche e epitopi eterologhe (comunemente indicato come "tag") attaccati alla proteina di scelta. Il DNA purificato da queste immunoprecipitati può essere utilizzato come modello in PCR (qPCR) reazioni quantitativa per valutare per l'arricchimento di particolari sequenze di interesse. In questo modo, i siti di legame di fattori di trascrizione o la distribuzione dei voti istone in particolari geni possono essere stabiliti 7,8. Inoltre, in combinazione con Next Generation Sequencing (NGS), che permette il sequenziamento massivo parallelo, tecnologia dei chip ha reso possibile l'identificazione a livello di genoma dei siti di legame di fattori di trascrizione e svelando i paesaggi epigenomiche di modificazioni degli istoni. Inoltre, l'analisi simultanea dell'espressione genica consente il monitoraggio come il legame di regolatori trascrizionali o deposizione di particolari segni istone correlare con trascrizionale activity di geni 9.
L'utilizzo di protocolli chip Arabidopsis ha permesso di valutare l'impatto che una varietà di regolatori trascrizionali hanno sull'organizzazione della cromatina di geni master di fioritura e di come questi cambiamenti strutturali influenzano l'espressione genica 5,6. Risultati precedenti hanno mostrato che la Arabidopsis locus VITE IN ANTICIPO IN GIORNI SHORT (EBS) agisce come repressore della fioritura e mutanti in questo gene mostrano un'accelerazione della fioritura e aumenta del gene maestro di FT fioritura. Inoltre, la perdita di funzione mutazioni in FT sopprimere completamente il fenotipo fioritura precoce delle piante EBS mutanti, indicando che FT è necessaria per la fioritura precoce di mutanti EBS e che EBS è necessaria per la rimozione di questo maestro gene della fioritura 10 , 11. EBS codifica per una proteina che contiene PHD che possono specificatamente legare dell'istone H3 di- e Trimethylated in the lisina 4 residuo (H3K4me2 / 3), suggerendo un ruolo per EBS nella repressione cromatina mediata di FT 12. L'uso del metodo ChIP dimostrato che l'Arabidopsis-PHD contenenti proteine EBS 10,11 lega regioni regolatorie del gene floreale integratore FT per reprimere la sua espressione 12. Ulteriori dati ottenuti tramite l'uso della tecnologia ChIP hanno dimostrato che questa proteina è necessario per mantenere bassi livelli di acetilazione degli istoni, un segno distintivo della trascrizione attiva, nella cromatina di questo maestro gene della fioritura durante le fasi iniziali dello sviluppo Arabidopsis. Queste osservazioni, insieme con i dati di espressione genetica e genica, dimostrare che questo Arabidopsis PHD-contenente proteina ha un ruolo centrale nella messa a punto di tempo di fioritura modulando l'espressione del gene integratore floreale FT 12. Il lavoro qui presentato fornisce un metodo ottimizzato utile non solo per l'analisi degli istoni ma anche per altricromatina proteine associate, e con una maggiore efficienza e riduzione dei tempi di sperimentale. Inoltre, la presente relazione illustra come l'uso di protocolli di chip ha fornito nuove informazioni sul rapporto tra cambiamenti nelle modificazioni della cromatina e stati trascrizionali di geni vegetali, e di come questi meccanismi cromatina mediata di impatto controllo dell'espressione genica sull'insorgenza della fioritura in Arabidopsis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo ChIP qui descritto è una tecnica riproducibile e potente per analizzare le interazioni tra proteine e specifiche sequenze di DNA in vivo in piante di Arabidopsis. Una individuazione di siti di legame per le proteine di interesse richiede un'adeguata selezione di organi vegetali o stadi di sviluppo in cui le interazioni rilevanti sono effettivamente avvenendo. Inoltre, è fondamentale per ottenere un fissaggio adeguato del materiale vegetale e un taglio ottimale della cromatina med…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Economìa y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).
Materials
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack – DynaMag™-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex® 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler® 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
Referências
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