Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN<em> In Vivo</em
Summary
Cromatina imunoprecipitação é uma técnica poderosa para a identificação de locais de Arabidopsis proteínas de ligação ao ADN in vivo. Este procedimento inclui a ligação cruzada da cromatina e fragmentação, imunoprecipitação com anticorpos selectivos contra a proteína de interesse, e análise de qPCR de DNA ligado. Nós descrevemos um ensaio ChIP simples otimizado para plantas de Arabidopsis.
Abstract
Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.
Introduction
Nos últimos anos, uma grande variedade de ferramentas genéticas, moleculares e genómicos foram desenvolvidos na Arabidopsis thaliana espécies modelo. Esta tecnologia tem facilitado enormemente o progresso na compreensão de como o desenvolvimento das plantas é regulamentada. Entre os processos de desenvolvimento de Arabidopsis utilizando estudadas como um modelo, o controlo genético do período de floração foi extensivamente analisado. Estes estudos têm mostrado que as plantas modular muito precisamente a época da floração em resposta a estímulos endógenos, tais como hormônios e da idade da planta, e também aos sinais ambientais, tais como fotoperíodo e temperatura que sincronizar o tempo de floração com o ciclo natural das estações 1, 2. O isolamento e caracterização de mutantes de Arabidopsis com alterações no tempo de floração tem sido determinante em revelar uma complexa rede de genes que regulam o tempo de floração em resposta a fatores endógenos e ambientais. Estes circuitos são genéticosintegrado no nível de alguns genes mestre que actuam como interruptores de floração, e o momento exacto do início floral depende do equilíbrio da floração promover e reprimir actividades que funcionam a montante dos genes integrador florais 1,3.
A caracterização funcional dos genes identificados pelo seu papel no controlo de início de floração, auxiliado pelo uso recente de abordagens genómicas, revelaram o papel central de regulação de transcrição na modulação do período de floração. Na verdade, muitos dos genes codificam mestre de floração fatores de transcrição 4. Além disso, um certo número de complexos de proteína de remodelação da cromatina influenciar a expressão de genes mestres de floração. Uma série de mutantes de Arabidopsis os isolados por seu tempo de floração alterado acabou por portadores de mutações em genes que codificam uma variedade de modificadores de cromatina. Diferentes empresas de reestruturação de cromatina que introduzem modificações pós-translacionais em Histone caudas, reposicionar nucleosomes relativos ao DNA ou trocar histonas canônicos por variantes de histonas são necessárias para a regulação da floração em Arabidopsis 5,6. Algumas destas actividades remodelação da cromatina catalisar a deposição ou a remoção de modificações covalentes, tais como a metilação ou acetilação de histonas em resíduos específicos. Estas marcas das histonas são especificamente reconhecidos pelos efectores especializados que recrutam outros complexos de remodelação da cromatina, factores de transcrição ou de componentes da maquinaria transcricional para regular a actividade transcricional de genes de floração.
Imunoprecipitação da Cromatina (ChIP) permite a identificação de locais in vivo de proteínas de interesse de ligação de ADN (Figura 1). Este procedimento tira vantagem da capacidade de certos produtos químicos para reticular as proteínas para o ADN. Os complexos ADN-proteína resultante pode ser então imunoprecipitadas utilizando anticorpos específicos AGAfactores de transcrição inst, proteínas de ligação de cromatina, ou modificações particulares e epítopos heterólogos (vulgarmente referidos como "etiquetas") ligados à proteína de escolha. O ADN purificado a partir de imunoprecipitados destes pode ser utilizado como um molde em PCR (qPCR) para avaliar as reacções quantitativos para o enriquecimento de sequências particulares de interesse. Deste modo, os sítios de ligação de factores de transcrição ou a distribuição de sinais de histonas em genes particulares pode ser estabelecido 7,8. Além disso, combinado com Next Generation Sequencing (NGS) que permite enorme sequenciamento paralelo, a tecnologia de chip tornou possível a identificação de todo o genoma dos sítios de ligação de fatores de transcrição, bem como paisagens epigenômicos inauguração de modificações de histonas. Além disso, a análise simultânea da expressão de genes permite a monitorização como a ligação dos reguladores da transcrição ou a deposição de marcas particulares histona correlaciona com a transcrição activity 9 de genes.
O uso de protocolos chip no Arabidopsis permitiu avaliar o impacto que uma variedade de reguladores de transcrição têm sobre a organização da cromatina de genes mestres da floração e como essas mudanças estruturais influenciar a expressão do gene 5,6. Resultados anteriores mostraram que a Arabidopsis lócus florescimento precoce em suma DIAS (EBS) atua como um repressor da floração e mutantes neste show gene uma aceleração da floração e da sobre-regulação do gene mestre do FT floração. Além disso, a perda de função mutações no FT suprimir totalmente o fenótipo de floração precoce das plantas EBS mutantes, indicando que FT é necessário para a floração precoce de mutantes de EBS e que a EBS é necessária para a repressão de este gene mestre de floração 10 , 11. EBS codifica uma proteína contendo PHD que se pode ligar especificamente histona H3 trimetilada em di- e the 4 resíduo lisina (H3K4me2 / 3), sugerindo um papel para EBS na repressão mediada por cromatina de FT 12. A utilização da abordagem ChIP demonstrou que a Arabidopsis contendo PHD proteína EBS 10,11 liga regiões reguladoras do gene FT integrador floral para reprimir a sua expressão 12. Os dados adicionais obtidos através do uso de tecnologia de chip mostrou que esta proteína é necessária para manter baixos níveis de acetilação da histona, uma característica da transcrição activa, na cromatina deste gene mestre de floração durante as fases iniciais de desenvolvimento da Arabidopsis. Estas observações, em conjunto com dados de expressão genética do gene e, demonstram que este Arabidopsis PHD contendo a proteína tem um papel central na regulação fina da época de floração através da modulação da expressão do gene integrador floral FT 12. O trabalho aqui apresentado fornece um método optimizado útil não só para a análise das histonas, mas também para a outracromatina proteínas associadas, e com o aumento da eficiência e redução do tempo experimental. Além disso, este relatório ilustra como o uso de protocolos de chip tem fornecido novos insights sobre a relação entre as mudanças em modificações da cromatina e estados de transcrição de genes de plantas, e como esses mecanismos mediados por cromatina de impacto controle da expressão gênica no início do florescimento em Arabidopsis.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito ChIP é uma técnica poderosa e reprodutível para analisar interacções entre proteínas e sequências específicas de ADN in vivo em plantas de Arabidopsis. A identificação bem sucedida de sítios de ligação para as proteínas de interesse requer uma seleção adequada de órgãos vegetais ou estágios de desenvolvimento, onde as interações relevantes estão realmente ocorrendo. Além disso, é essencial para se obter uma fixação adequada do material de planta e um corte óp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Economìa y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).
Materials
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack – DynaMag™-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex® 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler® 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
Referências
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