Хроматина иммунопреципитации для идентификации Arabidopsis взаимодействий белок-ДНК<em> В Vivo</em
Summary
Иммунопреципитации хроматина является мощным средством для идентификации ДНК сайтов связывания белков Arabidopsis в естественных условиях. Это процедура включает в себя хроматина сшивание и фрагментации, иммунопреципитацию с селективными антител против белка интереса, и КПЦР анализ связанного ДНК. Мы опишем простой ChIP анализа, оптимизированный для Arabidopsis растений.
Abstract
Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.
Introduction
В последние годы целый ряд генетических, молекулярных и геномных инструментов были разработаны в модельных видов Arabidopsis THALIANA. Эта технология способствовала чрезвычайно прогресс в понимании того, как развитие растений регулируется. Среди изучаемых процессов развития с помощью арабидопсиса в качестве модели, генетического контроля времени цветения широко проанализированы. Эти исследования показали, что растения модулировать очень точно время цветения в ответ на эндогенные сигналы, такие как гормоны и возраста растения, а также охраны окружающей среды сигналов, таких как фотопериода и температуры, которые синхронизируют цветущих время с естественным циклом времен года 1, 2. Выделение и характеристика мутантов Arabidopsis с изменениями в пору цветения был определяющим в раскрытии сложную сеть генов, которые регулируют время цветения в ответ на эндогенные и экологических факторов. Эти генетические схемы являютсяинтегрированы на уровне нескольких мастер-генов, которые действуют как переключатели цветения, а точные сроки начала цветочным зависит от баланса цветения поощрения и подавляя деятельность, которые работают вверх цветочных генов интеграторов 1,3.
Функциональная характеристика генов, идентифицированных за их роль в контроле цветения начала, опираясь на недавно использования геномных подходов, выявили центральную роль в регуляции транскрипции модуляции времени цветения. В самом деле, многие из мастер-генов цветения кодирования факторов транскрипции 4. Кроме того, ряд хроматина белковых комплексов влиять на экспрессию генов мастер цветения. Ряд Arabidopsis мутантов, выделенных для их измененной время цветения оказалось проводить мутации в генах, кодирующих различные модификаторы хроматина. Различные ремонтом хроматина, которые вводят посттрансляционные изменения в гистонае хвосты, изменить нуклеосом относительно ДНК или обменять канонические гистоны вариантами гистонов необходимы для надлежащего регулирования цветения Arabidopsis 5,6. Некоторые из этих хроматина деятельности ремоделирования катализировать осаждение или удаление ковалентных модификаций, таких как ацетилирование или метилирование гистонов в определенных остатков. Эти знаки гистонов специально признаны специализированных эффекторов, которые вербуют других хроматина комплексов, транскрипционные факторы или компоненты транскрипционного аппарата, чтобы регулировать транскрипционную активность генов цветения.
Иммунопреципитации хроматина (чип) позволяет идентифицировать в естественных условиях ДНК-сайтов связывания белков, представляющих интерес (рис 1). Эта процедура использует способности некоторых химических веществ для сшивания белков с ДНК. Полученные ДНК-белковые комплексы могут быть затем иммунопреципитировали с помощью специфических антител агаINST транскрипционные факторы, хроматин-связывающие белки, или конкретные модификации и гетерологичные эпитопы (как правило, называют "тегов"), присоединенный к белку выбора. ДНК очищают от этих иммуноосажденными может быть использован в качестве матрицы в ПЦР количественной (КПЦР) для оценки реакций для обогащения конкретных последовательностей, представляющих интерес. Таким образом, сайты связывания транскрипционных факторов или распределение гистоновых меток в определенных генов может быть установлено 7,8. Кроме того, в сочетании с нового поколения Секвенирование (NGS), что позволяет массовые параллельные последовательности, чип технология сделала возможным генома идентификации сайтов связывания транскрипционных факторов, а также открытие эпигеномном ландшафтов модификации гистонов. Кроме того, одновременный анализ экспрессии генов позволяет контролировать, как связывание транскрипционных регуляторов или отложение отдельных гистоновых меток коррелирует с транскрипционной деятельноти генов 9.
Использование протоколов чип в Arabidopsis позволило оценить влияние, которое различные транскрипционные регуляторы на организации хроматина мастер генов цветения и как эти структурные изменения влиять на экспрессию генов 5,6. Предыдущие результаты показали, что Arabidopsis локус РАНЬШЕ БОЛТЫ В короткие дни (EBS) действует как репрессор цветения и мутанты в этом гена шоу ускорение цветения и регуляция мастер гена цветения FT. Кроме того, с потерей функции мутации в FT полностью подавить раннее цветение фенотип EBS мутантных растений, что указывает FT требуется для преждевременного цветения EBS мутантов и что EBS является необходимым для подавления этого мастер гена цветения 10 11. EBS кодирует PHD-белок, содержащий, которые могут специфически связываться гистона H3 ди- и trimethylated в гое лизин 4 Остаток (H3K4me2 / 3), что свидетельствует о роли EBS в хроматина опосредованной репрессии FT 12. Использование подхода ChIP показали, что Arabidopsis PHD-белок, содержащий EBS 10,11 связывается регуляторных областей генов цветочной интегратор FT подавить выражение 12. Дополнительные данные, полученные путем использования чиповых технологий показали, что этот белок необходим для поддержания низких уровней ацетилирования гистонов, отличительной чертой активной транскрипции, в хроматина этого гена мастер цветения на начальных этапах развития Arabidopsis. Эти наблюдения, вместе с данными генетических и экспрессии гена, показывают, что это Arabidopsis PHD-содержащий белок играет центральную роль в тонкой настройке времени цветения путем модуляции экспрессии гена цветочные интегратора FT 12. Работа, представленная здесь обеспечивает оптимизированную метод полезен не только для анализа гистонов, но и для другойхроматина белков, ассоциированных и с повышенной эффективностью и уменьшить время эксперимента. Кроме того, в этом докладе показано, как использование протоколов чип новое понимание в отношениях между изменениями в модификации хроматина и транскрипционных состояний генов растений, и как эти хроматина опосредованной механизмов воздействия контроля экспрессии генов на возникновение цветения арабидопсиса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол чип описано здесь является воспроизводимым и мощная техника анализа взаимодействий между белками и специфических последовательностей ДНК в естественных условиях в Arabidopsis растений. Успешной идентификации сайтов связывания для белков, представляющих интерес требует ад?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Economìa y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).
Materials
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack – DynaMag™-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex® 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler® 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
Referências
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
