Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA<em> En Vivo</em
Summary
Inmunoprecipitación de la cromatina es una técnica poderosa para la identificación de ADN sitios de las proteínas de Arabidopsis unión in vivo. Este procedimiento incluye la cromatina entrecruzamiento y la fragmentación, inmunoprecipitación con anticuerpos selectivos contra la proteína de interés, y el análisis qPCR de ADN unido. Se describe un chip de ensayo sencilla optimizada para plantas de Arabidopsis.
Abstract
Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.
Introduction
Durante los últimos años una amplia gama de herramientas genéticas, moleculares y genómicos se han desarrollado en la especie modelo Arabidopsis thaliana. Esta tecnología ha facilitado enormemente el progreso en la comprensión de cómo se regula el desarrollo de la planta. Entre los procesos de desarrollo estudiados usando Arabidopsis como modelo, el control genético de la época de floración ha sido ampliamente analizado. Estos estudios han demostrado que las plantas modulan de forma muy precisa el momento de la floración en respuesta a las señales endógenas como las hormonas y la edad de la planta, y también a las señales ambientales como el fotoperiodo y temperatura que sincronizar el tiempo de floración con el ciclo natural de las estaciones 1, 2. El aislamiento y caracterización de mutantes de Arabidopsis con alteraciones en el momento de la floración ha sido determinante en la revelación de una compleja red de genes que regulan el tiempo de floración en respuesta a factores endógenos y ambientales. Estos circuitos son genéticosintegrado a nivel de unos pocos genes maestros que actúan como interruptores de floración, y el momento exacto de la iniciación floral depende del equilibrio de la floración la promoción y la represión de las actividades que funcionan aguas arriba de los genes integradores florales 1,3.
La caracterización funcional de los genes identificados por su papel en el control de la iniciación de la floración, ayudado por el uso reciente de enfoques genómicos, han puesto de manifiesto el papel central de la regulación transcripcional en la modulación del tiempo de floración. De hecho, muchos de los genes maestros de la transcripción codifican factores de floración 4. Además, un número de complejos de proteínas remodelación de la cromatina influye en la expresión de genes maestros de floración. Un número de los mutantes de Arabidopsis aislados por su tiempo de floración alterado resultó para llevar a mutaciones en genes que codifican una variedad de modificadores de la cromatina. Diferentes remodeladores de cromatina que introducen modificaciones postraduccionales en histone colas, reposicionar nucleosomas en relación con el ADN o el intercambio de histonas canónicos por variantes de histonas son necesarios para la adecuada regulación de la floración en Arabidopsis 5,6. Algunas de estas actividades de remodelación de la cromatina catalizan la deposición o eliminación de modificaciones covalentes tales como acetilación o metilación de residuos de histonas específicas. Estas marcas histonas son reconocidos específicamente por efectores especializados que reclutan a otros complejos de remodelación de la cromatina, factores de transcripción o componentes de la maquinaria de transcripción para regular la actividad transcripcional de los genes de floración.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) permite la identificación de sitios in vivo para proteínas de interés de unión a ADN (Figura 1). Este procedimiento se aprovecha de la capacidad de ciertos productos químicos para reticular las proteínas al ADN. Los complejos ADN-proteína resultantes pueden ser luego immunoprecipitated utilizando anticuerpos específicos agafactores inst transcripción, proteínas de unión a la cromatina, o modificaciones particulares y epítopos heterólogos (comúnmente conocidos como "etiquetas") unidos a la proteína de elección. El ADN purificado a partir de estos inmunoprecipitados se puede utilizar como una plantilla en PCR (qPCR) para evaluar las reacciones cuantitativas para el enriquecimiento de secuencias particulares de interés. De esta manera, los sitios de unión de factores de transcripción o la distribución de marcas de histona en los genes particulares pueden establecerse 7,8. Además, combinado con Next Generation Sequencing (NGS), que permite la secuenciación masiva en paralelo, la tecnología chip ha hecho posible la identificación de todo el genoma de los sitios de unión de factores de transcripción, así como revelando paisajes epigenómicos de modificaciones de las histonas. Además, el análisis simultáneo de la expresión génica permite la monitorización cómo la unión de reguladores transcripcionales o la deposición de marcas de histona particulares se correlacionan con la transcripción activity de genes 9.
El uso de protocolos de chip en Arabidopsis ha permitido evaluar el impacto que una variedad de reguladores de la transcripción tiene en la organización de la cromatina de los maestros genes de floración y cómo estos cambios estructurales influyen en la expresión de genes 5,6. Los resultados anteriores demostraron que el locus de Arabidopsis EMPERNADO TEMPRANO EN DÍAS CORTOS (EBS) actúa como un represor de la floración y los mutantes en este espectáculo gen una aceleración de la floración y la regulación positiva del gen maestro de FT floración. Además, la pérdida de función de las mutaciones en FT suprimen completamente el fenotipo de floración temprana de las plantas mutantes EBS, lo que indica que FT se requiere para la floración prematura de mutantes EBS y que EBS es necesario para la represión de este gen maestro de la floración 10 , 11. EBS codifica una proteína que contiene PHD-que pueden unirse específicamente di- histona H3 y trimetilada in the lisina 4 residuo (H3K4me2 / 3), lo que sugiere un papel para EBS en la represión de la cromatina mediada por FT 12. El uso del enfoque chip demostró que la Arabidopsis contiene PHD-proteína EBS 10,11 une regiones reguladoras del gen floral FT integrador para reprimir su expresión 12. Los datos adicionales obtenidos a través del uso de la tecnología chip demostraron que esta proteína es necesaria para mantener bajos niveles de acetilación de histonas, un sello distintivo de la transcripción activa, en la cromatina de este gen maestro de floración durante las etapas iniciales del desarrollo de Arabidopsis. Estas observaciones, junto con los datos de expresión genética y el gen, demostrar que esta proteína contiene PHD-Arabidopsis tiene un papel central en el ajuste fino del tiempo de floración mediante la modulación de la expresión del gen integrador floral FT 12. El trabajo presentado aquí proporciona un método optimizado útil no sólo para el análisis de las histonas, sino también para otrocromatina proteínas asociadas, y con el aumento de la eficiencia y reduce el tiempo de experimentación. Además, este informe muestra cómo el uso de protocolos de chip ha proporcionado nuevos conocimientos sobre la relación entre los cambios en la cromatina modificaciones y los estados de la transcripción de genes de plantas, y cómo estos mecanismos cromatina mediada de impacto control de la expresión génica en el inicio de la floración en Arabidopsis.
Protocol
Representative Results
Discussion
El chip de protocolo descrito aquí es una técnica reproducible y potente para analizar las interacciones entre proteínas y secuencias específicas de ADN in vivo en plantas de Arabidopsis. Una identificación exitosa de sitios de unión para las proteínas de interés requiere una adecuada selección de órganos de la planta o etapas de desarrollo, donde las interacciones relevantes en realidad están teniendo lugar. Además, es crítico para obtener una fijación adecuada del material vegetal y un óptimo d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Economìa y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).
Materials
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack – DynaMag™-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex® 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler® 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
Referências
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