FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
Fibroblastlar hücre dışı matriks salgılayan sorumlu ilke hücre tipi ve birçok organ ve dokuların kritik bir bileşenidir. Fibroblast fizyolojisi ve patolojisi birden organlarda fibrozların, hipertrofik skar aşağıdaki yanıklar, iskemi sonrası kardiyak fonksiyon kaybı ve kanser stroma oluşumu da dahil olmak üzere klinik kuruluşların, bir spektrum altında yatan. Ancak, fibroblastlar büyük ölçüde kendi içsel heterojenite, hücrenin kötü karakterize tip kalır. Fibroblastlar izolasyonu için mevcut yöntemler derinden hücre fenotipi ve davranışlarını etkileyen hücre kültüründe zaman gerektirir. Sonuç olarak, fibroblast biyoloji araştıran birçok çalışma, in vitro manipülasyon güvenmek ve doğru bir in vivo fibroblast davranışı yakalamak değil. Bu problemin üstesinden gelmek için, preservi böylece, hücre kültürü gerektirmez, yetişkin farelerin dorsal deri fibroblast izolasyonu için bir FACS tabanlı bir protokol geliştirilmiştirfizyolojik transkripsiyonel ve her hücrenin proteomik profili ng. Bizim stratejimiz soy negatif kapısı yoluyla olmayan mezenkimal soy dışlama sağlar (Lin -) oldukça spesifik yüzey belirteçleri ifade fibroblastlar bir alt ön seçim veya zenginleştirme önlemek ve bu heterojen genelinde mümkün olduğunca kapsayıcı olması için pozitif bir seçim stratejisi daha hücre tipi.
Introduction
Fibroblastlar sık plastik yüzeylerde uygun iğ biçimli hücreler olarak morfolojik tanımlanır. Fibroblastlar sentezlenmesi ve embriyonik ve yetişkin organlarının 1 hücre dışı matriks remodeling sorumlu ilke hücre tipi vardır. Fibroblastlar memeli gelişme dolayısıyla kritik ve her doku ve organda mevcut hücre tipleri komşu davranışını etkileyen hücre dışı ortamın önemli ölçüde katkıda bulunur.
Fibroblastlar de muazzam bir klinik yükünü neden tıbbi koşullar çeşitli bir kümesi arkasında asıl hücre tipi vardır. Patolojik fibroblast aktivitesinin normal doku işlevini bozar ve deri yara iyileşmesi, ateroskleroz, sistemik skleroz, ve damar yaralanması 2-5 sonra aterom plaklarının oluşumuna aşağıdaki doku ve (örneğin akciğer ve karaciğer gibi), organ fibrozis, skar içerir. Özellikle yara iyileşmesi, hem akut ve kronik, d içerirnormal doku gibi ne benzeyen, ne de işlevleri çevreleyen ve çeşitli patolojik devletler arasında önemli morbidite neden skar dokusunun eposition. Travmalarından sonra, daha sonra, yapısal ECM bileşenleri salgılar hücre tiplerini komşu parakrin etkilere neden ve skar dokusu 6 yatırma mekanik istikrarı sağlamak miyofibroblastlar fibroblastların bir geçiş vardır.
Deri dokularda gelişimsel süre boyunca yara onarım kalitesi ve anatomik siteler arasında önemli varyasyon mevcuttur. Yaşamın ilk iki trimesterde fetüs iz bırakmadan iyileşir; Ancak, üzerinde ve yetişkinlik boyunca üçüncü trimesterde, bir yara ile iyileşir insanlarda. Mevkiye-özgü yaşa özgü ek olarak, yara iyileşmesi farklılıklar vardır. Deri yaraların içinde skar dokusu biriktirme 9 önemli ise ağız boşluğunda yaralar, minimal skar oluşumu 7,8 ile pişmanlık. Münakaşa c devamyaş ve konum 10,11 hem açısından yara iyileşmesi sonucu yerel fibroblast içsel özelliklerinin karşı çevrenin göreceli etkisini oncerning. Deri dermis ve önceki embriyonik (E15) karşı sözlü fare iyileşmesinde önemli farklılıklar göz önüne alındığında vs sonra embriyonik (E18) dermiş, bazı gelişimsel yaşta ve çeşitli anatomik siteler arasında fibroblastların popülasyonlarında içsel farklılıklar var olasıdır .
1986 yılında, Harold F. Dvorak tümörler 12 iyileşmeyen yaralar vardır oturtulması. Dvorak tümörler vücutta yaralar gibi davranırlar ve konağın yanıtını yaranın iyileşme aktive ederek stroma neden olduğu sonucuna varıldı. Çeşitli çalışmalar beri karsinom 13-15 ilerlemesine fibroblastların katkısını araştırdık, ama yara iyileşmesi, kimlik ve deri ca stromal bölmesine katkıda fibroblast embriyonik kökenli olduğu gibircinomas yeterince tanımlanmamıştır. Bu sorunun cevabı, anti-kanser terapisi 16 için potansiyel olarak etkin hedef olarak tümörle ilişkili fibroblast açığa son çalışmalar verilen tıbbi alaka taşımaktadır.
Belirlenmesi ve ileriye dönük in vivo fibrojenik potansiyeli sahip fibroblast soy izole etkin bir akut ve kronik hastalık durumları geniş bir yelpazesinde yaralanma kendi tepkisini manipüle yönelik önemli bir adımdır. 1987 yılında, Cormack papiller ve retiküler dermis 17,18 içinde biri içinde ikamet eden fibroblast iki alt popülasyonlarını bir gösterdi. Üçüncü ICSI'nin follikül 19,20 Dermal papilla bölgedeki saç köklerinin ile ilişkili bulunmuştur. Ne zaman kültür, büyüme potansiyeli, morfoloji ve büyüme faktörü / sitokin bu fibroblast alt tiplerinin sergi farkları 21-24 profilleri.
Bugüne kadar, fibroblast inceleyen çalışmaların oterogeneity ölçüde yeterli in vivo fibroblastlar arasında gelişimsel ve fonksiyonel çeşitlilik karakterize etmek başarısız oldu. Bu, kısmen, kültürlenmiş fibroblast popülasyonları bir güven ve tüm fibroblastlar 25 ile ifade edilen bir kendi kendine yüzey reseptörüne göre hücre kültüründen ya da pozitif bir seçim homojenize etkisinin bir sonucu olduğu. Laboratuarımızda yapılan yeni bir çalışma, derin bir yüzey işaretleyici ve bu yazıda 26 sunulan FACS-bazlı izolasyon metodolojisi ile izole vs kültürlü kültürsüz fibroblast transkripsiyonel vardiya gösterdi.
Daha sonra, kemirgen dorsal dermiş içinde belirli bir fibroblast soy tanımlanmış ve Engrailed-1 embriyonik ekspresyonu ile tanımlanan, bu soy, dorsal, derideki bağ dokusu birikimi için temel olarak sorumlu olduğu tespit edilmiştir. Yara iyileşmesi, kanser stroma oluşumu da dahil olmak üzere fibrozis, akut ve kronik biçimleri boyunca da soy fonksiyonlarıRadyasyon fibrozis 27 uyarılan. Farklı fibroblast soy karakterizasyonu fibrojenik davranışlarını modüle amaçlayan tedaviler için kritik etkileri vardır.
Aksine, hücre izolasyonu 28,29 ulaşmak için in vitro manipülasyon güvenmek mevcut protokolleri kullanarak daha burada ayrıntılı hasat protokolü (Şekil 1) daha doğru in vivo fenotip ve davranışlarını yakalamak fibroblast verimi bilgilendirici analizlerini yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda tarif edilen protokol, bir alt seçmek ya da daha sonraki analizler yapılmadan önce, hücre kültüründe bir zaman gerektiren ya mevcut yöntemlere kıyasla, FACS-bazlı sıralama ile fibroblastlar izole etmek için bir araç sunmaktadır. Fibroblast sıralama için cildin hasat gerekli süre yaklaşık 6 saattir; Bununla birlikte, hasat kullanılan farelerin sayısı, bu tahmin etkileyecektir.
Protokolde birkaç nokta özellikle dikkat gerektirir. İlk izolasyon prosesi esnas?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma (HPL için) NIH hibe R01 GM087609, (MTL) (HPL için) Anthony Shu, NIH hibe U01 HL099776 onuruna Ingrid Lai ve Bill Shu bir Hediyesi, Hagey Laboratuvarı için bir hibe ile kısmen desteklenmiştir Pediatrik Rejeneratif Tıp ve Meşe Vakfı (MTL, GCG ve HPL). GGW Tıp Stanford School, Stanford Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı tarafından desteklenen ve NIGMS eğitim bursu GM07365 oldu. ZNM Plastik Cerrahi Vakfı Araştırma Bursu Grant ve Hagey Aile Fonu tarafından desteklenmiştir. MSH California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) Klinik Fellow eğitim bursu TG2-01159, Çene Hastalıkları Cerrahlar American Society (ASMS) / Çene-Yüz Cerrahları Vakfı (MSF) Araştırma Bursu Ödülü ve Transplantasyon ve Doku Mühendisliği Bursu Ödülü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
Referências
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
- Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
- Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
- Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
- Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
- Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
- Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
- Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
- Cormack, D. H. . Ham’s Histology. , 450-474 (1987).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
- Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
- Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
- Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
- Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough – Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).
