Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
Fibroblasten zijn het principe celtype belast afscheiden extracellulaire matrix en zijn een kritische component van vele organen en weefsels. Fibroblast fysiologie en pathologie grondslag een spectrum van klinische entiteiten, zoals fibrose in meerdere organen, hypertrofische littekenvorming na brandwonden, verlies van hartfunctie na ischemie en de vorming van kanker stroma. Echter, fibroblasten blijft een slecht gekarakteriseerde type cel, grotendeels te wijten aan hun inherente heterogeniteit. Bestaande werkwijzen voor het isoleren van fibroblasten tijd nodig in celcultuur die diep beïnvloedt celfenotype en gedrag. Bijgevolg, veel onderzoeken naar fibroblast biologie vertrouwen op in vitro manipulatie en niet nauwkeurig fibroblast gedrag in vivo vast te leggen. Om dit probleem te overwinnen, ontwikkelden we een op FACS gebaseerde protocol voor de isolatie van fibroblasten uit de dorsale huid van volwassen muizen die celkweek niet vereist, waardoor preserving de fysiologische transcriptie en proteomics profiel van elke cel. Onze strategie zorgt voor uitsluiting van niet-mesenchymale lijnen via een geslacht negatieve gate (Lin -) in plaats van een positieve selectie strategie om de pre-selectie of verrijking van een subpopulatie van fibroblasten voorkomen expressie van specifieke oppervlakte markers en zo inclusief mogelijk over dit heterogene celtype.
Introduction
Fibroblasten zijn dikwijls morfologisch gedefinieerd als spoelvormige cellen die hechten aan plastic substraten. Fibroblasten het principe soort cel verantwoordelijk voor het synthetiseren en remodeling de extracellulaire matrix in embryonale en volwassen organen 1. Fibroblasten zijn derhalve cruciaal voor de ontwikkeling van zoogdieren en substantieel bijdragen aan het extracellulaire milieu die het gedrag van naburige celtypen in elk weefsel en orgaan beïnvloedt.
Fibroblasten zijn ook de belangrijkste celtype achter een gevarieerde set van medische aandoeningen die enorme ziektelast veroorzaken. Pathologische fibroblast activiteit belemmert normaal weefsel functie en omvat weefsels en organen fibrose (zoals de longen en lever), littekenvorming na cutane wondgenezing, atherosclerose, systemische sclerose, en de vorming van atheroomplaques na bloedvat letsel 2-5. Wondgenezing in het bijzonder, zowel acuut als chronisch, gaat deposition van littekenweefsel dat noch lijkt op noch functies zoals het normale weefsel eromheen, en leidt tot aanzienlijke morbiditeit in diverse pathologische toestanden. Na verwonding, er een overgang van fibroblasten naar myofibroblasten, die vervolgens afscheiden structurele ECM componenten uitoefenen paracriene effecten op naburige celtypen en mechanische stabiliteit te herstellen door het afzetten van littekenweefsel 6.
In cutane weefsel bestaat er aanzienlijke variatie in de kwaliteit van wondherstel over ontwikkelingstijd en tussen anatomische plaatsen. In de eerste twee trimesters van het leven geneest de foetus zonder littekens; echter, het derde trimester aan en op volwassen leeftijd, mensen genezen een litteken. Site-specifieke, naast leeftijdsspecifieke verschillen in wondgenezing bestaan. Wonden in de mondholte verbouwen met minimale littekenvorming 7,8, terwijl littekenweefsel afzetting binnen cutane wonden significant is 9. Controverse blijft concerning de relatieve invloed van de omgeving ten opzichte van de intrinsieke eigenschappen van lokale fibroblasten van de uitkomst van wondgenezing met betrekking tot zowel leeftijd als locatie 10,11. Gezien de aanzienlijke verschillen in de genezing van muis orale vs. cutane dermis en minder embryonale (E15) vs. latere embryonale (E18) dermis, is het waarschijnlijk dat de intrinsieke verschillen in de populaties van fibroblasten op bepaalde ontwikkelingsleeftijd en over verschillende anatomische plaatsen bestaan .
In 1986 Harold F. Dvorak geponeerd tumoren zijn wonden die niet genezen 12. Dvorak geconcludeerd dat tumoren gedragen als wonden in het lichaam induceren hun stroma door activering van de wondheling respons van de gastheer. Talrijke studies hebben sindsdien onderzocht de bijdrage van fibroblasten om de progressie van carcinomen 13-15, maar zoals bij wondgenezing, de identiteit en embryonale oorsprong van de fibroblasten die bijdragen aan het stromale compartiment van cutane carcinomas is niet voldoende gedefinieerd. Het antwoord op deze vraag draagt medisch belang aangezien recente studies blootstellen van de tumor-geassocieerde fibroblasten als een potentieel effectieve doelwit voor anti-kankertherapie 16.
Identificeren en prospectief het isoleren van de fibroblast geslachten begiftigd met fibrogene potentieel de vivo is een essentiële stap op weg naar effectief manipuleren hun reactie op letsel in een breed scala van acute en chronische ziekten. In 1987, Cormack aangetoond twee subpopulaties van fibroblasten, één die binnen de papillaire en één in de reticulaire dermis 17,18. Een derde subpopulatie bleek geassocieerd met haarfollikels in de huidpapilla regio van de follikel 19,20. Wanneer gekweekt, deze fibroblast subtypen vertonen verschillen in groeipotentieel, morfologie en groeifactor / cytokinen profielen 21-24.
Tot op heden, studies naar fibroblast hijterogeneity zijn grotendeels gefaald om adequaat te typeren ontwikkelings- en functionele diversiteit onder fibroblasten in vivo. Dit is deels het gevolg van een afhankelijkheid van gekweekte fibroblasten populaties en homogeniseren effect van celkweek of positieve selectie op basis van een zelf oppervlaktereceptor niet alle fibroblasten 25 uitgedrukt. Een recente studie van ons laboratorium aangetoond een diepe oppervlak marker en transcriptie verschuiving in gekweekte versus onbeschaafde fibroblasten geïsoleerd door de FACS gebaseerde isolatie methodiek die in dit manuscript 26.
Vervolgens identificeerden we een specifiek fibroblast geslacht binnen de muriene dorsale dermis en vastgesteld dat deze lijn, gedefinieerd door embryonale expressie van Engrailed-1, primair verantwoordelijk bindweefsel vormen in de dorsale huid. De lineage functies tijdens zowel acute als chronische vormen van fibrose waaronder wondheling, kanker stroma vorming enstraling veroorzaakte fibrose 27. De karakterisering van verschillende fibroblast geslachten heeft kritieke implicaties voor therapieën die gericht zijn op het moduleren fibrogene gedrag.
In plaats van bestaande protocollen die berusten op in vitro manipulatie celisolatie 28,29 verwezenlijken, zal de oogst protocol (figuur 1) hier beschreven opbrengst informatieve analyses van fibroblasten die nauwkeuriger fenotype en gedrag in vivo te vangen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit manuscript beschreven protocol biedt een middel om fibroblasten geïsoleerd door FACS gebaseerde sortering, vergeleken met bestaande methoden, die hetzij selecteren voor een subpopulatie of tijd in celkweek vereisen voordat verdere analyses. De tijd vereist vanaf de oogst van de huid om het sorteren van fibroblasten ongeveer 6 uur; echter zal het aantal muizen gebruikt bij de oogst van deze schatting beïnvloeden.
Een aantal punten in het protocol vereist bijzondere zorg. De eerste…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund in het kader van een subsidie van de NIH-subsidie R01 GM087609 (tot HPL), een geschenk van Ingrid Lai en Bill Shu ter ere van Anthony Shu (tot HPL), NIH-subsidie U01 HL099776 (tot MTL), de Hagey Laboratorium voor Pediatric Regenerative Medicine en The Oak Foundation (naar MTL, GCG en HPL). GGW werd gesteund door de Stanford School of Medicine, de Stanford Medical Scientist Training Program, en NIGMS training subsidie GM07365. Znm werd gesteund door de Plastic Surgery Research Foundation Fellowship Grant en de Hagey Family Fund. MSH werd ondersteund door het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Klinische Fellow training subsidie TG2-01159, de American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS) / kaakchirurgen Foundation (MSF) Research Grant Award en de Transplant en Tissue Engineering Fellowship Award.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
Referências
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
- Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
- Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
- Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
- Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
- Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
- Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
- Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
- Cormack, D. H. . Ham’s Histology. , 450-474 (1987).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
- Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
- Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
- Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
- Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough – Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).
