Purificação e redobramento de amilóide fibrilas de (seu)<sub&gt; 6</sub&gt; tagged proteína recombinante Shadoo Expresso como Corpos de Inclusão em<em&gt; E. coli</em

Resumo

Um método cromatográfico de duas etapas é descrito para a purificação da proteína Shadoo recombinante expressa como corpos de inclusão em Escherichia coli, bem como um protocolo para fibrilar Shadoo purificado em estruturas amilóides.

Resumo

O sistema de expressão de Escherichia coli é uma ferramenta poderosa para a produção de proteínas eucarióticas recombinantes. Nós usá-lo para produzir Shadoo, uma proteína pertencente à família de prião. Um método de cromatografia para a purificação de (His) ₆ tagged Shadoo recombinante expressa como corpos de inclusão é descrito. Os corpos de inclusão solubilizados em ureia 8 M e ligado a uma coluna de Ni ²⁺ -charged para realizar cromatografia de afinidade de iões. As proteínas ligadas são eluidas com um gradiente de imidazole. As fracções contendo proteína Shadoo são submetidas a cromatografia de exclusão de tamanho para obter uma proteína altamente purificada. No passo final é purificado Shadoo dessalinizada para remover os sais, ureia e imidazole. Shadoo proteína recombinante é um reagente importante para estudos bioquímicos e biofísicos de distúrbios conformação da proteína que ocorrem nas doenças de priões. Muitos relatórios demonstraram que as doenças neurodegenerativas priões são originários da deposição de facadale, ordenou fibrilas amilóides. Protocolos de exemplo que descrevem como fibrilar Shadoo em fibrilas amilóides no ácido e neutro / pHs básicos são apresentados. Os métodos de como produzir e fibrilar Shadoo pode facilitar a investigação em laboratórios que trabalham com doenças de príon, uma vez que permite a produção de grandes quantidades de proteína de uma maneira rápida e de baixo custo.

Introdução

Doenças neurodegenerativas causadas por príons, que incluem a encefalopatia espongiforme bovina em bovinos, scrapie em ovinos ea doença de Creutzfeldt-Jakob em humanos, são fatal e incurável. Prion doenças são caracterizadas por mudanças conformacionais da proteína príon celular composta principalmente de hélices, no-β-sheet cruz enriquecido amilóide conformer ^1,2. Cross-beta-estruturas contêm densamente embalado e beta-folhas-cristalinos como altamente ordenadas estabilizado com ligações de hidrogênio ^3,4. Amyloids Príon se auto-replicar devido aos beta-fios na borda crescente que fornecem um modelo para recrutar e converter uma unidade de prot....

Protocolo

1. Produção de plasmídeo e Shadoo Expressão

Nota: O gene que codifica a proteína de murino Shadoo (Shadoo ^25-122), foi subclonado no vector de expressão ^pET-28 11. Este clone foi usado para transformar E. SoluBL21 coli estirpe bacteriana, para expressar a proteína Shadoo com uma etiqueta de hexa-histidina N-terminal, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG), como explicado anteriormente ^11. O plasmídeo pode ser solicitado dos autores. O peso molecular calculado a partir da Shadoo sua sequência de aminoácidos ....

Resultados

Cerca de 5-10 mg de proteína Shadoo purificado é obtido por litro de cultura bacteriana. A purificação em duas fases é necessário para obter Shadoo recombinante de elevado grau de pureza. A primeira etapa é realizada por cromatografia de afinidade com uma coluna de Ni ²⁺ -charged que conserva as suas-proteínas marcadas. As fracções eluídas são sujeitas a SDS-PAGE e corados com Coomassie Brilliant Blue (Figura 5A). As fracções que contêm proteína são reunidas e Shadoo adicionalmente purificado.......

Discussão

Um protocolo de fácil e eficiente tanto para expressão e purificação de uma grande quantidade de proteína recombinante de ratinho Shadoo é apresentado. O método descrito permite a solubilização e purificação bem sucedida de (His ₆₎ tagged Shadoo proteína recombinante. É importante, tal como referido no título, que quando expresso em uma bactéria procariota E. Shadoo coli acumula-se em corpos de inclusão. Antes da purificação Shadoo, as bactérias têm que ser lisadas por sonicação em um tampão.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AKTA FPLC	GE, Amersham	# 1363
HiLoad 16/60	Superdex GE Healthcare	17-1069-01
HiTrap IMAC	GE Healthcare	GE17-0920-05
HiPrep26/10 Coluna de dessalinização	GE Healthcare	GE17-5087-01
SoluBL21 Competente E. coli	Genlantis	C700200
pET-28b+	Novogen	69865-3
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
LB-Broth médio	Sigma-Aldrich	L3022
Eppendorf Biophotometar	Eppendorf	550507804
Trito X-100	Life Technologies	85111
NiSO4	Sigma-Aldrich	656895
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	RES3098T
Comprimidos de Coquetel Inibidor de Protease	Roche	4693116001
NaCl	Sigma-Aldrich	746398
Imidazol	Sigma-Aldrich	I5513
Gdn-HCl	Sigma-Aldrich	G4505
marcador de tamanho de proteína	Thermo Fisher Scientific	26620