Tuning een parallelle gesegmenteerd Flow Column en Multiplexed Detection inschakelen

Summary

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Abstract

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Introduction

Active Flow Technology Columns

Actieve stroom technologie (AFT) chromatografiekolommen werden onlangs ontwikkeld tot inefficiëntie in scheidingen in verband met stroom heterogeniteit ^1-6 te overwinnen en ook multiplex detectie mogelijk te maken. In dit specifieke communicatie we detail het operationele proces van de parallelle gesegmenteerde stroom (PSF) kolom met multiplex detectie. De belangrijke functionele voordelen van de kolom PSF zijn: (1) de stroom vanaf de radiale centrale gebied van het kolombed wordt geïsoleerd van het perifeer of wandgebied van stroming, (2) het volume van de mobiele fase die moet worden verwerkt door een detectie- bron wordt verminderd, en (3) detectie bronnen kunnen worden gemultiplext om monsterinformatie uitzetten zonder wekken detectie vertraging over elke detectieproces of later noodzakelijk de splitsing van een postkolom vloeistofstroom ^7,8. Het belangrijkste kenmerk van het ontwerp van de kolom PSF dat het mogelijk maakt eendvantage gemultiplexte detectie is de nieuwe outlet fitting en frit samenstel. Figuur 1 is een foto van de AFT kolom opzichte van een conventionele kolom. Het is belangrijk te begrijpen dat het splitsingsproces verkregen met evenwijdige gesegmenteerde stroom kolommen is niet hetzelfde als postkolom flows splitsen. In een postkolom vloeistofstroom gesplitst het gehele monster band van de voorste rand aan de uiteinden van de staart gelijkelijk bemonsterd (dwz axiaal) daardoor elke flows gelijk met betrekking tot de efficiëntie en gevoeligheid; de omvang van de gevoeligheid aldus gedeeld door het aantal splitsingen. In PSF, maar de splitsing proces monsters van de band radiaal, niet axiaal. Als zodanig, de centrale poort monsters de top bedraagt ​​- het meest geconcentreerde gebied van de piek. Dus de gevoeligheid hier de hoogste piek niet wordt verdund door de diffuse staart regio. Het monster elueren uit het perifere havens is niet zo efficiënt als de central zone, maar omdat de band radiaal wordt bemonsterd in plaats van axiaal, de breedte van de piek is smaller dan het geval zou een bemonsteringsproces dat de piek verdeelt in axiale richting, dat wil zeggen een postkolom worden gesplitst. Vandaar de gevoeligheid bij een concentratie afhankelijke detector niet verminderd.

In de kolom PSF, de uitlaat fitting omvat meerdere uitlaatpoorten en aan de binnenkant van de eindfitting wordt gehuisvest een ringvormige frit. Het binnenste deel van deze ringvormige frit kanalen stromen uit de kolom via de radiale centrale uitlaat poort, terwijl de buitenste radiale gedeelte van de uitlaat frit kanalen uit de kolom stroomt via de perifere of wand regio stopcontact stroom poorten. De binnenste en buitenste gedeelten van de uitlaat frit worden gescheiden door een ondoordringbare barrière die dwarsstroom tussen deze stromingsgebieden ² verhindert. Als gevolg van dit ontwerp de centrale radiale stroming stroom door de kolom bed wordt gescheiden van het wandgebied stroom inside de kolom. Het relatieve aandeel van stroom uit deze twee gebieden worden gevarieerd om bijna elk gewenste verhouding tot drukbeheer om verschillende functionele aspecten van de kolomtechnologie, zoals scheidingsefficiëntie of detectiegevoeligheid optimaliseren. In wezen is dit ontwerp effectief vast binnen de grotere format kolom een "virtueel kolom heeft smallere inwendige diameter, en dus de kolom functioneert als een echte wall-less kolom overwinnen zuilenbed heterogeniteit en de wandeffecten ^9,10.

De belangrijkste voordelen van PSF kolommen verbetering kolomefficiëntie, minimalisering van het oplosmiddel voor het opsporen source (s) en mogelijk gemultiplexte detectie. Echter, een extra voordeel is dat aangezien de staart en fronting gebieden van elke band worden verwijderd uit de algemene elutieprofiel de opgeloste stof aan elutie of detectie aanwezig in een hogere concentratie dan anders zou worden waargenomen voor hetzelfde solute injectie en concentratie belasting van een conventionele kolom, afhankelijk van de segmentering toegepaste verhouding. Als gevolg hiervan is er vaak waargenomen een winst in signaalintensiteit voor scheidingen uitgevoerd op PSV kolommen ^2. In feite, als de segmentatie verhouding wordt ingesteld dat 25% van de stroom verlaat elk van de vier uitlaatopeningen, de signaalintensiteit die wordt waargenomen onder toepassing van ultraviolet (UV) detectie toont vrijwel exact dezelfde signaalintensiteit zoals duidelijk met een gewone kolom waarin de volledige (100%) van de mobiele fase wordt geanalyseerd ^7. Bovendien fijnafstelling van de uitlaat verhouding tussen de centrale en de wand stromingsgebieden kan de kolom efficiëntie te optimaliseren. De winst in kolomefficiëntie waargenomen via AFT kolommen kan niet worden gesteld aan een enkele waarde, omdat deze efficiëntie is afhankelijk van drie factoren: (1) de stroomsnelheid, (2) de segmentatie verhouding, en (3) de opgeloste stof retentiefactor . Toch winst in efficiëntie in vergelijking met conventional kolommen zijn bijna altijd waargenomen, en soms deze winsten meer dan 100% van het aantal theoretische schotels ^1,2. De mogelijkheid om af te stemmen de segmentatie verhouding laat de analist effectief maat van de diameter van de "virtuele" kolom, en dit is een belangrijke factor met betrekking tot het detectieproces. Zo wordt een virtuele 2,1 mm diameter (id) kolom interne opgericht vanuit fysisch 4,6 mm id kolom wanneer de segmentatie verhouding 21% van de mobiele fase elueren van het radiale centrale uitlaatpoort. Onder deze omstandigheden is de virtuele 2,1 mm kolom id uitvoert met een efficiëntie die meer dan 70% groter is dan de gebruikelijke 2,1 mm id kolom kan, afhankelijk van de stroomsnelheid en opgeloste retentiefactor ^10.

De huidige kolom PSF ontwerp dat wordt gebruikt voor gemultiplexte detectie omvat een 4-poort uitlaatfitting, maar de kolom kan worden uitgerust met een 2-port-eindstuk echter ook beperkt dit detectie to twee detectoren. De basiswerking van deze kolommen is echter hetzelfde, behalve dat vier detectoren simultaan kunnen worden gekoppeld aan de 4-port outlet column PSF een uitbreiding van het gemultiplexte detectie. Naast pre- en post-kolom verbindende buis, het enige aanvullende eisen op een kolom PSF actief is buis die kan worden aangesloten op de perifere uitlaatpoorten, en een middel waarmee de hoeveelheid van de mobiele fase die door elke buis kan worden gemeten, meestal ofwel een massa meting of een volumetrische meting. Voor het gemak van tuning wordt de inwendige diameter van uitlaatstroom buizen hetzelfde zijn. De stroomverhouding tussen de perifere en radiale centrale uitgangsopeningen wordt vervolgens gevarieerd door het gebruik van drukbeheer, simpelweg door de lengte van de buis op het perifere uitlaatfitting, of buisstuk bericht detector op de radiale centrale uitlaatpoort.

Multiplexed Detectie Met behulp van Columns PSF </strong>

Een belangrijk voordeel van PSF kolommen is dat elk van de uitlaat uitlaatpoorten direct kan worden aangesloten op een detectie-bron, waardoor gemultiplexte detectie. In een goed ontworpen detectiesysteem één analyse multiplex detectie kan essentiële informatie met betrekking tot de aard van de componenten in het monster. Belangrijk kunnen destructieve en niet-destructieve tests uitgevoerd op exact hetzelfde tijdstip, zonder detectie vertraging. Hierdoor kan de absolute toewijzing van bijvoorbeeld antioxidantia gebruikt DPPH ^• reagens, met componenten waargenomen elueer met UV- en / of massaspectrometrie (MS) detectie responsen ^7,11. Daarom kunnen vier onafhankelijke detectors gelijktijdig worden bediend met geschikte porties stroom naar iedere detector via een van de vier afvoeropeningen. Aangezien de stroom door deze poorten gemakkelijk kunnen worden aangepast aan de hoeveelheid opgeloste stof bereiken een van de detectoren kan worden aangepast aan suitde gevoeligheid van de detector bepaalde bron. Opgemerkt zij echter dat de doeltreffendste opgeloste migratie waargenomen door het radiale centrale uitlaatpoort. Elk van de perifere poorten bieden gelijkwaardige scheidingsefficiëntie die, wanneer ingesteld op 25% door elke poort, slechts iets minder efficiënt dan een conventionele kolom. Als zodanig is het belangrijk dat de kwantitatieve detector ingesteld op monster van de radiale centrale uitlaatopening analyseren.

Bij het opzetten van een kolom PSF behoeve van multiplexen detectie zijn er een aantal overwegingen die moeten worden gedaan om efficiënte en hoogwaardige resultaten; dat buisafmetingen voor elke poort, de keuze van welke poort voor een type detector en flow adjustment.

Buis Afmetingen voor elke poort

In chromatografie lengte van postkolom buis speelt een cruciale rol in de efficiëntie en prestaties van de scheiding. Grote dead-volume als gevolg van lange of brede id slang van kolomuitlaat naar detector leidt tot een rendementsverlies, resolutie en gevoeligheid. Zo moet de juiste afmetingen slangen worden gebruikt bij het opzetten van de kolom PSF om het maximale potentieel te bereiken in het leveren van efficiënte scheiding, terwijl het verstrekken van de voordelen van multiplexing.

Poort naar Detector

Figuur 2 is een illustratie van een voorbeeld configuratie van gemultiplexte detectie (Ultra Violet-Visible (U-Vis) massaspectrometer (MS) en 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH ^•) detectie). De afbeelding toont de centrale poort naar de MS-detector bevestigd, terwijl de DPPH ^• en UV-Vis detectoren zijn bevestigd aan de perifere poorten. Omdat de MS is de meest gevoelige detector van de drie stromen naar deze detector is gericht van het centrale uitlaatpoort. Zoals DPPH ^• opsporing is selectief aan de Presence van antioxidanten, en het minst gevoelig en meest tolerant bandverbreding, stromen naar deze detector werd geleid vanuit een perifere poort. De UV-Vis was een secundaire 'generieke' detector, zodat de stroom naar deze detector werd geleid vanuit een tweede perifere poort.

Flow adjustment

Zodra aan de buis is bevestigd uit een haven detector, kan de uitgaande stroom uit elk van de detectors worden aangepast aan de gewenste hoeveelheid. Een eenvoudige manier om de hoeveelheid stroom verlaten van elke detector meten is de hoeveelheid van de mobiele fase die elueert door elke poort over een bepaalde tijdsperiode te wegen. Het percentage stroom kan dus worden bepaald, en de stroom verhoudingen kunnen worden ingesteld door hetzij verkorten of verlengen van de slang verbonden met de uitlaatleiding van de detektoren daarom aan de vereisten van de detektoren keuze passen. Verschillende detectoren hebben verschillende eisen van stroom, bijvoorbeeld de stroomcel vaneen fluorescentie detector (FLD) niet debiet beperkt, maar zorg moet worden genomen om overdruk van de stroomcel voorkomen. Vandaar de regeling van stroming door de FLD wordt gewoonlijk bereikt door het aanpassen van de drukval over de andere detectoren en de rest van de stroom gaat dan door de FLD. Een detector die gevoelig is voor de hoeveelheid stroom die geleverd is het MS. In het algemeen kan de huidige high-end massaspectrometers gemakkelijk verwerken rond 1 tot 1,5 ml / min van matig waterige mobiele fase. Boven dit debiet, kan overstroming van de bron de MS onbruikbaar te maken. Echter, gevoeligheid in de meeste massaspectrometers geprofiteerd door lagere debieten; vandaar de PSF stroom splitsing mogelijkheden zijn uiterst nuttig voor toepassingen waarbij MS detectie. Hoge kolom debiet kan worden toegepast, maar met een laag volume ladingen vervoerd naar de MS-detector. Afstemmen van de stroom naar de MS-detector, moet echter heeft plaatsgevonden door de drukval voor deMS-detector, in plaats van na de MS. Hier is het gebruik van smalle boring buis (0,1 mm id) is zeer nuttig, wanneer de druk gemakkelijk kan worden aangepast zonder toevoeging ongepast dood volume.

Afhankelijk van het type detector aanpassing van de segmentatie verhouding kan worden gedaan vóór of na detector. Wanneer een niet-destructieve detector, zoals UV-Vis wordt gebruikt, zou het percentage stroom worden gemeten en ingesteld na detector. Als een vernietigende detector wordt gebruikt in het opzetten multiplex de stroom percentage wordt bepaald door berekening weer op de andere poort stroming percentages. Als een reagens gebaseerde detector wordt gebruikt zoals DPPH ^• wordt de stroom gemeten percentage bericht detector zonder toevoeging van reagens; en als twee of meer destructieve detectoren worden toegepast dan de stroomverhouding wordt gemeten pre-detector. Detectie systemen die extra instrumentatie, zoals DPPH ^• kan eisen, zal extra druk van het systeem die de stroom kunnen veranderen hebbenpercentage eenmaal bevestigd aan het detectiesysteem. Daarom moet een zorgvuldige afweging worden besteed aan de systeemdruk van een destructieve detector, bij het aanpassen van stroom percentage pre-detector. Ongeacht de stroom verhouding die is ingesteld door middel van een van de havens, moeten kwantitatieve informatie worden verkregen door middel van passende standaardisatie. Zodra de stroom verhoudingen zijn ingesteld, maar ze zijn robuust, en ze niet veranderen, zelfs onder omstandigheden gradiëntelutie ^7,

Is bedoeld de gedetailleerde video protocol bij dit manuscript te laten zien hoe te gebruiken en af ​​te stemmen een kolom PSF functioneren in een multiplex wijze van opsporing.

Protocol

Opmerking: Dit protocol bevat instructies over hoe je een column PSF te gebruiken op een HPLC-systeem in combinatie met meerdere detectoren voor multiplex detectie. Het protocol is geschreven ervan uitgaande dat de lezer heeft basiskennis en ervaring in chromatografie en diverse HPLC detectiemethoden. Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor alle materialen en reagentia voor het gebruik (dwz, MSDS voor methanol). Zorg ervoor dat het gebruik van alle nodige veiligh…

Representative Results

Een gemultiplexte HPLC-analyse werd uitgevoerd met een AFT kolom PSF stand (figuur 1) en ingesteld zoals weergegeven in figuur 2. Dit type installatie kon een koffiemonster gelijktijdig worden geanalyseerd met UV-Vis, DPPH • en MS in Total Ion Count (TIC) modus. De verbindingen van de koffie monster die reageerden op DPPH • kan vervolgens eenvoudig worden aangepast aan de UV-Vis en MS – TIC antwoorden op basis van de uitlijning van de retentietijd zoals geïllu…

Discussion

Deze studie heeft betrekking op de karakterisering en profilering van koffie met behulp van HPLC met multiplex detectie gebruik van een parallelle gesegmenteerde stroom (PSF) kolom. Multiplexed HPLC met PSF kolommen maakt de karakterisering en identificatie van belangrijke chemische entiteiten door het verminderen van de complexiteit gegevens van het monster terwijl het verkrijgen van een grotere molecuul-specifieke informatie binnen een fractie van de tijd die met gebruikelijke multi-detectie werkwijzen. De kolom PSF m…

Materials

HPLC instrument			Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
Column stoppers	Any brand		For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels