Abstimmen eines Parallel Segmented Flow Säule und Aktivieren von Mehrfachanalysen

Summary

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Abstract

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Introduction

Aktive Flow Technology Columns

Aktive Flow-Technologie (AFT) Chromatographiesäulen wurden kürzlich entwickelt, um Ineffizienz bei Trennungen mit Flußheterogenität ^1-6 zu überwinden und auch zu Mehrfachdetektion zu ermöglichen. In diesem speziellen Kommunikations wir ausführlich die Betriebsprozess der parallel segmentiert Strom (PSF) Säule mit Multiplex-Detektion. Die wichtigsten funktionalen Vorteile der PSF Spalte sind: (1) die Strömung von der radialen Mittelbereich des Säulenbett von dem Peripheriegerät oder Wandbereich der Strömung isoliert ist, (2) das Volumen der mobilen Phase, die durch ein Erfassungs verarbeitet werden müssen, Quelle reduziert wird, und (3) Detektion Quellen können gemultiplext werden, um Probeninformationen ohne Einträufeln Detektionsverzögerungen für jeden Erfassungsvorgang oder nachfolgend erfordern die Spaltung eines Nachsäulenderivatisierung Strömung ^7,8 erweitern. Das Schlüsselmerkmal in der Gestaltung der PSF Spalte, die eine ermöglichtV orteil gemultiplexter Detektion ist die neuartige Auslaßarmatur und Fritte Montage. 1 ist eine Fotografie des AFT Spalte im Vergleich zu einem herkömmlichen Spalte. Es ist wichtig zu verstehen, dass das Spaltverfahren unter Verwendung von parallelen segmentierten Flusssäulen ist nicht die gleiche wie Nachsäulenderivatisierung Strömung Spaltung erhalten. In einer post-Säule Strömung spaltete die gesamte Probe-Band von der Vorderkante zu den Extremitäten des Schwanzes wird gleichmäßig abgetastet (dh axial), wodurch, gleich in Bezug auf Effizienz und Empfindlichkeit jeder Strömungsstrom; der Betrag der Empfindlichkeit wodurch er geteilt durch die Anzahl spaltet. In PSF jedoch die Spaltprozess tastet das Band radial, axial nicht. Als solche sind die zentrale Öffnung tastet das Peakspitzen – die konzentrierten Bereich des Peaks. Somit ist die Empfindlichkeit hier höchste als Peak nicht durch die diffuse Tailing Bereich verdünnt. Die Probe durch Elution von den peripheren Ports ist nicht so effizient wie in der CentraL-Zone, aber, da das Band radial abgetastet, anstatt axial, ist die Breite der Spitze geringer als es der Fall für einen Abtastprozeß, der die Spitze in der Axialrichtung teil, dh eine Nachsäulenderivatisierung aufgeteilt werden. Daher ist die Empfindlichkeit mit einem konzentrationsabhängigen Detektor wird nicht reduziert.

In der PSF-Spalte umfasst die Auslaßarmatur mehreren Austrittsöffnungen und an der Innenseite dieses Endstück ist ein ringförmiger Fritte gebracht. Der innere Abschnitt dieses ringförmigen Fritte Kanäle strömen aus der Kolonne über den radialen zentralen Auslaßöffnung, während der äußere radiale Teil der Auslassfritte Kanäle strömen aus der Kolonne über den peripheren Wandbereich oder Austrittsströmungsöffnungen. Die inneren und äußeren Abschnitte des Auslassfritte werden durch eine undurchlässige Barriere, die Querströmung zwischen diesen Strömungsbereichen ² verhindert getrennt. Als Folge dieser Konstruktion der zentrale radiale Strömung durch das Säulenbett wird von den Wandbereich fließen ins abgetrenntide die Spalte. Der relative Anteil der Strömung aus diesen beiden Bereichen kann auf fast jedem gewünschten Verhältnis durch Druckregelung, um verschiedene funktionale Aspekte der Säule Technik wie Trennleistung oder die Nachweisempfindlichkeit zu optimieren variiert werden. Im wesentlichen stellt diese Konstruktion effektiv in dem größeren Format Spalte eine Spalte "virtuelle", mit einem engeren Innendurchmesser und damit die Funktionen der Spalten als eine wahre wandlosen Spalte Überwindung Säulenbett Heterogenität und die Wandeffekte ^9,10.

Die Hauptvorteile der PSF-Säulen sind Verbesserungen in Säuleneffizienz, Minimierung des Lösungsverarbeitung zur Detektion Quelle (n) und damit eine Mehrfachdetektion. Ist jedoch ein zusätzlicher Vorteil, dass seit der Tailing und Fronting Regionen jeder Band aus dem Gesamt Elution entfernt Profile den gelösten Stoff bei Elution oder Detektion in einer höheren Konzentration, als es sonst für die gleichen s einzuhalten vorhanden istolut Einspritzung und der Konzentration Last auf einer herkömmlichen Säule, in Abhängigkeit von der Segmentierung Verhältnis eingesetzt. Als Folge gibt es oft eine Verstärkung der Signalintensität für Trennungen auf PSF ^Spalten 2 geführt beobachtet. In der Tat, wenn die Segmentierungsverhältnis so eingestellt wird, dass 25% der Strömung tritt aus jedem der vier Ausgangsanschlüsse, die Signalstärke, die mit ultraviolettem (UV) Detektion beobachtet weist praktisch genau die gleiche Signalintensität offensichtlich unter Verwendung eines herkömmlichen Spalte, wo die gesamte (100%) der mobilen Phase analysiert ^7. Ferner eine Feinabstimmung des Austrittsverhältnis zwischen der zentralen und Wandströmungsbereiche ermöglicht die Säuleneffizienz zu optimieren. (1) die Durchflussrate, (2) die Segmentierung Verhältnis, und (3) der gelöste Stoff Retentionsfaktor: Die Gewinne in der Säuleneffizienz mit AFT Spalten können nicht auf einen einzelnen Wert anzugeben, da diese Effizienzgewinne sind eine Funktion der drei Faktoren zu beachten . Dennoch Effizienzgewinne im Vergleich zu konventionelle Spalten sind fast immer beobachtet und manchmal diese Gewinne sind mehr als 100% der Zahl der theoretischen Trennstufen ^1,2. Durch die Manipulation der die Segmentierungsverhältnis erlaubt es dem Analysten effektiv anzupassen den Durchmesser der Säule "virtuelle", und dies ist ein wichtiger Faktor in Bezug auf die Erkennung aktiviert. Beispielsweise wird eine virtuelle Durchmesser (id) -Säule 2,1 mm Innen aus physikalischer 4,6 mm ID-Säule hergestellt wird, wenn die Segmentierungsverhältnis 21% der mobilen Phase eluiert von der radialen zentralen Austrittsöffnung. Unter diesen Bedingungen führt die 2,1 mm-ID-Säule virtuelle mit einer Effizienz, die mehr als 70% größer ist als die herkömmlichen 2,1 mm-ID-Säule sein kann, abhängig von Durchflussmenge, und Stoffretentionsfaktor ^10.

Die aktuelle PSF Spalte Design, das für die Multiplex-Nachweis verwendet wird, umfasst ein 4-Port Auslassfitting, aber die Spalte kann versehen sein mit einem 2-Port-End-Montage auch begrenzt jedoch diese Erkennung to nur zwei Detektoren. Der Grundbetrieb dieser Spalten ist jedoch derselbe, außer daß vier Detektoren gleichzeitig zu dem 4-Port-Auslass PSF Spalte der Geltungsbereich zur Mehrfachdetektion gekoppelt werden. Abgesehen von Pre-und Post-Säule Verbindungsschläuche, die nur zusätzliche Anforderungen, um eine PSF Kolonne betrieben wird Schlauch bis in die Rand Auslassöffnungen verbunden werden kann, und ein Mittel, mit dem die Menge der mobilen Phase, die durch jedes Rohr gemessen werden kann, typischerweise entweder eine Massenmessung oder eine volumetrische Messung. Zur Erleichterung der Tuning, sollte der Innendurchmesser aller Abströmung Schläuche die gleiche sein. Das Strömungsverhältnis zwischen den peripheren und radialen zentralen Austrittsöffnungen wird dann durch die Verwendung von Druckregelung, indem einfach die Länge der Rohrleitung auf der Umfangsauslaufarmatur oder die Länge der Rohrpost Detektor auf der radialen zentralen Auslassöffnung befindet variiert.

Multiplex-Nachweis unter Verwendung PSF Columns </strong>

Ein wichtiger Vorteil der PSF Spalten ist, dass jede der Austrittsaustrittsöffnungen können direkt auf ein Erfassungsquelle verbunden werden, wodurch Multiplex-Detektion. In einem gut gestalteten Nachweissystem eine einzelne Analyse mit Mehrfachdetektion können sachdienliche Informationen in Bezug auf die Art der Komponenten in der Probe bereitzustellen. Wichtig ist, dass zerstörende und zerstörungsfreie Prüfungen an genau der gleichen Zeit durchgeführt werden kann, ohne Erfassungsverzögerung. Dies ermöglicht die absolute Zuordnung von zum Beispiel Antioxidationsmittel mit DPPH ^• Reagens mit Komponenten beobachtet mit UV- und / oder Massenspektrometrie (MS) Erfassungsantworten ^7,11 eluieren. Daher können vier unabhängigen Detektoren gleichzeitig mit entsprechenden Anteilen der Strömung zu jeder Detektor über jede der vier Auslaßöffnungen gerichtet betrieben werden. Da die Strömung durch diese Anschlüsse können Sie bequem die Menge des gelösten Stoffes Erreichen einer der Detektoren eingestellt werden können, um Anzug angepasst werdendie Empfindlichkeit des gegebenen Detektor Quelle. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass die effizienteste Migration gelöster Stoff ist durch die radiale zentrale Auslaßöffnung beobachtet. Jedes der Peripheriegerätetore gleichwertige Abscheidegrad, die, wenn sie zu 25% durch jeden Port wird, ist nur geringfügig weniger effizient als eine herkömmliche Säule. Als solches ist es wichtig, dass das Mengendetektor eingestellt Probe von der radialen zentralen Austrittsöffnung zu analysieren.

Beim Einrichten eines PSF Kolonne zwecks Multiplexdetektion gibt es eine Reihe von Überlegungen, die vorgenommen werden, um effiziente und hochwertige Ergebnisse erzielt werden müssen; dh Rohrabmessungen für jeden Port, Wahl, welche Port für einen Detektortyp und Durchflusseinstellung.

Rohr Abmessungen für jeden Port

In der Chromatographie spielt die Länge des Pfostens Spalte Schlauch eine entscheidende Rolle in der Effizienz und Leistung der Trennung. Große dead-Volumen infolge der langen oder breiten id Schlauch vom Säulenausgang zum Detektor wird in einem Verlust an Effizienz, Auflösung und Empfindlichkeit führen. Somit entsprechende Schlauchdimensionen bei der Einrichtung der PSF Spalte das maximale Potential der Bereitstellung effiziente Trennung zu gewährleisten und gleichzeitig die Vorteile des Multiplex erreichen, verwendet werden.

Port-Detektor

Figur 2 ist eine Darstellung eines beispielhaften Aufbau des Multiplexdetektion (Ultra Violet-Visible (U-Vis), Massenspektrometer (MS) und 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH ^•) Erkennung). Die Abbildung zeigt die zentrale Port wird der MS-Detektor angebracht ist, während die DPPH ^• und UV-Vis-Detektoren sind mit den peripheren Ports angeschlossen. Da die MS ist die empfindlichen Detektor der drei, zu fließen, um diesen Detektor wurde von der zentralen Auslassöffnung gerichtet ist. Wie DPPH ^• Erkennung ist selektiv auf die Presence von Antioxidantien und die am wenigsten empfindliche und besonders tolerant gegenüber der Bandverbreiterung, fließen, um diesen Detektor wurde von einer Peripherieschnittstelle gerichtet ist. Das UV-Vis war ein Sekundär "Generika" Detektors, so fließt dieser Detektor wurde von einer zweiten Peripherieschnittstelle gerichtet ist.

Flow Adjustment

Sobald die geeignete Rohre ist von einem Port zu Detektor angebracht ist, sind die Austrittsströmung von jedem der Detektoren auf das erforderliche Maß eingestellt werden kann. Ein einfacher Weg, um die Menge der Strömung, die aus von jedem Detektor zu messen, ist die Menge der mobilen Phase, die durch jeden Anschluss über einen gegebenen Zeitraum eluiert wiegen. So kann der Prozentsatz Fluss bestimmt werden, und die Strömungsverhältnisse kann entweder durch Verkürzung oder Verlängerung der Schlauch an der Ausgangsleitung auf die Detektoren angebracht entsprechend den Anforderungen der Detektoren der Wahl zu entsprechen angepasst werden. Verschiedene Detektoren verschiedene Anforderungen der Strömung beispielsweise die Durchflusszelle voneinen Fluoreszenzdetektor (FLD) nicht Strömungsgeschwindigkeit begrenzt, aber es muss darauf geachtet werden, einen Überdruck von der Strömungszelle zu vermeiden. Damit die Regelung von Strömung durch das FLD wird normalerweise durch Einstellen des Druckabfalls über der anderen Detektoren und der Rest der Strömung gelangt dann durch die FLD erreicht. Ein Detektor, der empfindlich für die Menge der Strömung, die abgegeben wird, ist die MS. Im Allgemeinen können aktuelle High-End-Massenspektrometer leicht verarbeiten rund 1 bis 1,5 ml / min mäßig wässrige mobile Phase. Oberhalb dieser Durchflussrate kann Hochwasser der Quelle machen die MS nicht mehr funktioniert. Allerdings ist die Nachweisempfindlichkeit in den meisten Massenspektrometer unter Verwendung von niedrigeren Durchflussraten profitiert; damit die PSF Stromteilung Funktionen sind sehr nützlich für Anwendungen mit MS-Detektion. Hohe Säulenvolumenströmen verwendet werden, aber mit Raumbelastungen niedrig, um den MS-Detektor transportiert. Abstimmen der Strömung zu dem MS-Detektor muss jedoch durch Einstellen des Druckabfalls vor dem gemacht werdenMS-Detektor, sondern als Beitrag MS. Hier ist die Verwendung von engen Bohrung Schlauch (0,1 mm id) sehr nützlich, da der Druck leicht ohne Zugabe unangemessen Totvolumen eingestellt werden.

Abhängig von der Art des Detektors die Einstellung der Segmentierungsverhältnis kann entweder vor oder nach dem Detektor durchgeführt werden. Wenn ein zerstörungsDetektor, wie zum Beispiel UV-Vis verwendet wird, würde die Strömung in Prozent gemessen und abgestimmt Postdetektor sein. Wenn ein einzelner destruktiven Detektor ist in dem Multiplex-Einrichtung verwendet, die Durchflussprozent durch Rück Berechnung in Bezug auf andere Port Flussprozentsätze festgelegt. Ein Reagenz, basierend Detektor wie DPPH ^• verwendet wird, wird die Strömungs Prozent gemessen Post-Detektor ohne die Zugabe von Reagens; und wenn zwei oder mehr destruktiv Detektoren verwendet werden, dann das Strömungsverhältnis wird pre-Detektor gemessen. Detection-Systeme, die zusätzliche Instrumentierung, wie DPPH ^• erfordern, werden zusätzliche Systemdruck, die die Strömung verändern kannProzent einmal, um das Erfassungssystem angebracht ist. Daher sollten sich sorgfältig überlegen, Systemdruck von einer destruktiven Detektor, bei der Einstellung Durchflussprozent Pre-Detektor bezahlt werden. Unabhängig von der Stromverhältnis, das durch einen der Ports festgelegt ist, sollten quantitative Informationen über entsprechende Standardisierung erreicht werden. Sobald die Strömungsverhältnisse eingestellt werden, jedoch sind sie robust, und sie haben nicht einmal unter Gradientenelution Bedingungen ⁷ zu ändern,

Das dieses Manuskript beiliegenden ausführlichen Video-Protokoll soll zeigen, wie man eine PSF Spalte Funktionieren in einem Multiplex-Modus der Erkennung verwenden und Melodie.

Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll enthält eine Anleitung, wie man ein PSF-Säule auf einem HPLC-System in Verbindung mit mehreren Detektoren zur Mehrfachdetektion zu verwenden. Das Protokoll geschrieben wurde unter der Annahme der Leser grundlegende Kenntnisse und Erfahrung in der Chromatographie und HPLC verschiedenen Nachweismethoden. Achtung: Bitte den Sicherheitsdatenblätter (MSDS) für alle Materialien und Reagenzien beziehen sich vor der Verwendung (dh MSDS für Methanol). Achten Si…

Representative Results

Ein Multiplex-HPLC-Analyse wurde unter Verwendung eines AFT-Spalte in PSF-Modus (Abbildung 1) durchgeführt und wie in Abbildung 2 dargestellt eingestellt. Erlaubt Diese Art von Setup eine Kaffeeprobe gleichzeitig mit UV-Vis, DPPH • und MS in Gesamt analysiert werden Ion Count (TIC) Modus. Die Verbindungen der Kaffeeprobe, die DPPH • reagierte könnte dann leicht bis in den UV-Vis und MS angepaßt werden – TIC Antworten basierend auf der Ausrichtung der Halteze…

Discussion

Diese Studie umfasst die Charakterisierung und Profilierung von Kaffee unter Verwendung von HPLC mit Multiplex-Nachweis unter Verwendung eines parallelen segmentierten Flusses (PSF) Spalte. Multiplex HPLC mit PSF Säulen ermöglicht die Charakterisierung und Identifizierung der wichtigsten chemischen Einheiten durch eine Verringerung der Daten Komplexität der Probe unter Gewinnung einen höheren Grad der molekülspezifischen Information in einem Bruchteil der Zeit, die unter Verwendung von herkömmlichen Mehrfachnachwe…

Materials

HPLC instrument			Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
Column stoppers	Any brand		For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels