컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해
Summary
자가 및 동종 골 이식의 주입은 주요 두개 안면 뼈 손실을 치료하는 방법을 받아 구성한다. 그러나 혈관 신생, 세포 분화 및 골 형성 간의 상호 작용에 그래프트 조성물의 효과는 불분명하다. 우리는 이식 근접에서 혈관 신생 골 형성의 상호 의존성을 규명하는 것을 목표로 멀티 모달 이미징 프로토콜을 제시한다.
Abstract
뼈 이식 절차의 성공을 결정하는 중요한 매개 변수는 그래프트를 둘러싼 영역의 혈관이다. 우리는 풍부한 혈관 형성에 의해 더 많은 골 재생을 유도 할 뼈 이식술의 주입을 가설을 세웠다. 결함 부위에서 신생 혈관에 이식 효과를 조사하기 위해, 우리는 중합 성 조영제와 동물의 조직 관류를 포함 혈관 형성 새롭게 특성화 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 접근 방법을 개발 하였다. 이 방법은 전체 기관의 자세한 혈관 분석을 할 수 있습니다. 또한, 혈액 관류 혈액 유래 형광 제의 형광 이미징 (FLI)를 사용하여 평가 하였다. 골 형성은 수산화 인회석 타겟 프로브 μCT 분석을 사용하여 정량 하였다 FLI. 줄기 세포 모집 오스테오칼신 프로모터의 제어 하에서 루시페라아제를 발현 트랜스 제닉 마우스의 생물 발광 영상 (BLI)에 의해 모니터링 하였다.다음은 설명과 동종의 제조, 두개골 결함 수술을 보여, 혈관 신생 연구하고 (조영제의 생체 내 관류를 포함) 골 형성 분석 및 데이터 분석을위한 프로토콜 μCT 주사 프로토콜.
맥관 구조의 3D 고해상도 분석 특히 세동맥 포메이션에 대하여,자가 이식으로 이식 동물에서 상당히 큰 혈관을 보여 주었다. 따라서, 혈액 관류는 수술 후 7 일째에 의한자가 이식 군에서 유의하게 높았다. 우리는자가 이식을받은 동물에서 우수한 뼈 광물 및 측정보다 골 형성을 관찰했다. 세포는 7 일 및 10 일 사이의 수술후 일 골 형성 세포로 분화 그래프트 호스트 뼈 봉합,자가 이식에 의한 주입 상주 줄기 세포 모집. 이 결과는 강화 된 골 형성이에 기인 할 수 있음을 의미자가 이식 주입의 특징을 증강 혈관 먹이입니다. 방법은 단단히 경계 골 형성 및 신생 혈관의 관점에서 골 재생을 연구하는 최적의 도구로 역할을 할 수있다 묘사했다.
Introduction
외상, 종양 절제, decompressive 개두술 및 선천성 결함에 대한 두개 안면 뼈 손실은 거의 그 자체로 치유하지 않고 명확한 충족되지 임상 필요성을 제시한다. 자가 뼈 이식과 동종 골 이식이 광범위하게 이러한 조건 1을 치료하는 데 사용된다.
널리 혈관 신생 골 형성이 단단히 2,3- 결합되는 것을 허용한다. 따라서, 뼈 재생을위한 제안 치료의 전체 연구는 전체 결함의 위치를 통하여 형성하는 혈관 나무의 포괄적 인 조사를 포함해야한다. 연구 모델에서 혈관의 특성을 몇 가지 가능한 방법이 있습니다. 혈관 나무는 조직 학적 분석을 통해 조사 할 수있다. 조직학은 조직을 절편에 의존하기 때문에, 결과 이미지가 왜곡 될 가능성이 높은있다. 이 문제를 해결하기 위해, 생체 내에 현미경 이미지 본래의 혈관 (4)에 수행 될 수있다; 그러나,이 방법은하나의 평면 영상으로 제한. 조영제로 관류 동물에서 얻은 검체의 μCT 검사는 재생 사이트 (5)를 공급하는 혈관 네트워크의 3D 영상을 수 있습니다. 이 접근법은 전체 기관의 혈관의 매우 상세한 데모뿐만 아니라 혈관 분포의 치밀한 분석을 허용한다. 또한, μCT 혈관의 서로 다른 아형을 특성화 혈관 직경의 변화 사이의 차별화를 가능하게한다.
우리는 동종 이식의 이식보다 큰 혈관 신생을 유도하는 두개골 이식술의 주입을 가정하고, 이것은 우리가 다양한 기술을 사용이 가설을 추구 formation.To 강화 뼈, 차례로, 신생 혈관이 이어질 것 증가했다. 우리 μCT 기반 분석을 수행하여 새로 형성된 혈관의 나무 무늬를 조사 하였다. 우리는 혈액 풀 형광 프로브를 이용하여 혈류를 측정 하였다. 다음으로, 엉덩이하이드 록시 아파타이트 지시 프로브 및 μCT 분석 FLI으로 나오지 뼈 조직 광물. 마지막으로, 우리는 오스테오칼신 루시페라아제 양성 세포에서 발현하는 형질 전환 마우스에서 BLI을 수행하는 줄기 세포의 분화 및 모집을 모니터.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 조영 방법의 목적은 뇌신경 골 이식의 맥락에서 혈관 신생 골 형성의 축 세심한 조사를 가능하게하는 것이다. 신생 혈관은 뇌 전체 결함 공급 혈관 트리의 정확한 고해상도 3D 데모 허용 μCT 프로토콜을 사용하여 영상화 하였다. μCT 데이터 용이 IPL 같은 소프트웨어와 같은 고급 툴을 사용하여 분석 될 수있다. 예를 들어,도 3c에 도시 된 두께 분석 뇌 자가골 이식과의 주요 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
Referências
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