Computertomografi og optisk avbildning av Osteogenesis-angiogenese Kobling til Vurdere Integrering av kraniet autografts og allografter
Summary
Implantasjon av autologe og allogene bein grafts utgjør akseptert tilnærminger til å behandle store kraniofaciale bentap. Likevel effekten av graft sammensetning på samspillet mellom neovascularization, celledifferensiering og beindannelse er uklart. Vi presenterer en multimodal bildebehandling protokoll forsøkte å belyse angiogenese-osteogenesis gjensidig avhengighet på pode nærhet.
Abstract
En viktig parameter å bestemme suksessen til et bein pode prosedyren er vaskularisering av området rundt pode. Vi antok at implantasjon av et bein autograft ville indusere større benregenerering av frodig blodkardannelse. For å undersøke effekten av graftet i neovaskulariseringen i det defekte område, har vi utviklet en mikro-computertomografi (μCT) tilnærming til å karakterisere nylig danne blodkar, som involverer systemisk perfusjon av dyret med et polymeriserende kontrastmiddel. Denne metoden gjør det mulig detaljert vaskulær analyse av et organ i sin helhet. I tillegg ble blodperfusjon vurdert ved hjelp av fluorescens imaging (FLI) av en blodbårne fluorescerende agent. Bendannelse ble kvantifisert ved FLI bruke en hydroksyapatitt-målrettet sonde og μCT analyse. Stamcelle rekruttering ble overvåket ved bioluminescens imaging (BLI) av transgene mus som uttrykker luciferase under kontroll av osteocalcin promoteren.Her beskriver og demonstrerer fremstillingen av allograft, calvarial defekt kirurgi, μCT skanning protokoller for neovaskularisering studier og bendannelse analyse (inklusive in vivo perfusjon av kontrastmiddel), og protokollen for dataanalyse.
3D høy oppløsning analyse av vaskulaturen viste signifikant større angiogenese hos dyr med implantert autografts, særlig med hensyn til arterioler formasjonen. Følgelig blodperfusjon var signifikant høyere i autograft gruppen ved den 7. dagen etter operasjonen. Vi observerte overlegen beinmineralisering og målt større beindannelse hos dyr som fikk autografts. Autograft implantasjon indusert bosatt stamcelle rekruttering til graft-host bein sutur, der cellene differensiert i bendannende celler mellom 7. og 10. postoperative dag. Dette funnet betyr at økt beindannelse kan tilskrivesaugmented vaskulær fôring som karakteriserer autograft implantasjon. Metodene avbildet kan tjene som et optimalt verktøy for å studere benregenerering i form av tett avgrenset beindannelse og neovascularization.
Introduction
Kraniofaciale bentap på grunn av traumer, tumor reseksjon, decom kraniotomi, og medfødt defekt sjelden helbreder seg selv og presenterer et klart udekket klinisk behov. Autologe bein grafts og allogene bein grafts er mye brukt til å behandle disse forholdene 1.
Det er allment akseptert at osteogenesis er tett koblet med angiogenese 2,3. Således bør fullstendig studium av et slått terapi for benregenerering inkludere en omfattende undersøkelse av det vaskulære treet danner hele defekte område. Det er flere tilgjengelige metoder for å karakter vaskularisering i forskningsmodeller. Vaskulære treet kan undersøkes ved histologisk analyse. Siden histologi er avhengig av seksjonering vev, er det stor sannsynlighet for at det resulterende bildet vil bli forvrengt. For å løse dette problemet, kan intramikroskopi utføres til bilde intakt blodkar 4; Imidlertid er denne metodenbegrenset til en plan-imaging. μCT scanning av prøver hentet fra et dyr dynket med kontrastmiddel tillater 3D avbildning av det vaskulære nettverket som mater regenerering nettstedet fem. Denne tilnærmingen muliggjør en meget detaljert demonstrasjon av et organ vaskulatur som helhet, samt en grundig analyse av blodkarfordelingen. Videre gjør μCT differensiering mellom ulike diametre av blodkar, som karakteriserer de ulike subtyper av blodkar.
Vi antok at implantering av et calvarial autograft vil indusere neovaskularisering er større enn implantasjon av en allograft, og denne økte neovaskularisering fører i sin tur til økt bein formation.To følge denne hypotesen vi benyttet en rekke teknikker. Vi undersøkte mønstre av den nydannede vaskulær treet ved å utføre en μCT basert analyse. Vi målte blodperfusjon bruker en blod-pool fluorescerende probe. Neste, vi eslersed benvev mineralisering av FLI av hydroksyapatitt styrt sonde og μCT analyse. Til slutt overvåkes vi stamcelle rekruttering og differensiering, utføre BLI i transgene mus som luciferase er uttrykt i osteocalcin-positive celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med multimodale avbildningsfremgangsmåter som er beskrevet her, er å muliggjøre grundig undersøkelse av angiogenese-osteogenesis aksen i sammenheng med kraniebentransplantering. Neovascularization ble avbildes med en μCT protokollen, som tillot en nøyaktig høyoppløselig 3D-demonstrasjon av vaskulær treet fôring hele kranie defekt. μCT data lett kan analyseres ved hjelp av avanserte verktøy som IPL programvare. For eksempel kan tykkelsen analysen er vist i figur 3C …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
Referências
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
