We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.
For de fleste pattedyr patogener, har genuttrykk profilering studier blitt begrenset av tekniske vanskeligheter å nøyaktig kvantifisere patogen gentranskriptene fra infiserte vev. Patogen RNA utgjør en liten del av det totale RNA isoleres fra infiserte vevsprøver. Både microarray og RNAseq teknologiene har vanskeligheter med å generere pålitelige leser for svakt uttrykt patogen gener. Mutant patogene stammer med redusert in vivo spredning utgjøre en enda større utfordring. Her beskriver vi pt de vivo genuttrykk profilering protokoll som er svært rask, ekstremt følsom og reproduserbar. Vi utviklet denne protokollen under etterforskning av sopp patogen Candida albicans i en musemodell hematogen disseminert candidiasis. Ved hjelp av denne protokollen, har vi dokumentert gang kurs av dynamisk regulert C. albicans genuttrykk under nyre infeksjon, og oppdaget uventede trekkgenuttrykk svar på soppdrepende behandling in vivo.
Genuttrykk dynamikk har viktig informasjon om hvordan en celle reagerer på endringer i miljøet. I tilfelle av en infiserer mikrobe, kan genekspresjonsdata gi klinisk relevante innsikt i hvordan en patogen tilpasser seg infeksjonen miljøet og forårsaker skade på verten. I de siste to tiårene, har genuttrykkstudier både de vitro og in vivo generert store mengder data og lagt et grunnlag for å forstå infeksjon biologi 1-3. Men dagens profilering teknologier inkludert microarray og RNAseq, er ikke optimal for profilering av patogen genuttrykk under infeksjon. Verts RNA utgjør en overveldende del (vanligvis> 99%) av den totale RNA isoleres fra infiserte vevsprøver. Verten RNA bidrar til høy bakgrunn på mikromatriser, og dominerer sekvens leser fra RNAseq. Patogen celle isolert fra infisert vev, i teorien, kan hjelpe til å anrike for patogen RNA, men det utgjør tilsetningal problemer: det krever store mengder infisert vev; prosedyren kan være kjedelig; og viktigst av alt, er det vanskelig å bevare den opprinnelige tilstand eller integritet RNA under langvarig prosess. For å generere mer omfattende og nøyaktige data om patogen genuttrykk under reelle infeksjoner, setter vi ut for å utvikle en protokoll som gjør det mulig pålitelig og kostnadseffektiv kvantifisering av minoritets RNA arter i en blandet RNA befolkning.
NanoString NCounter er en nylig utviklet plattform som gjør direkte multiplex måling av genuttrykk ved hjelp av digitale strekkodet probe par 4, 5. Har denne plattformen en følsomhetsnivå sammenlignes med QRT-PCR, men krever ikke enzymatisk forsterkning. Teknologien er ikke genom-wide, det tillater påvisning av opptil 800 forskjellige gener i hver analyse. Derfor er det viktig å velge informative gener som prober for profilering. Her bruker vi genuttrykk profilering studie av et større humet patogen, Candida albicans, i løpet av en invasiv infeksjon som et eksempel, for å demonstrere: 1) Tekniske data for den eksperimentelle prosedyrer (Protocol), 2) Følsomheten, reproduserbarhet og dynamisk område av denne metoden (representative resultater), og 3) Viktig betraktninger for å utforme og utføre eksperimenter basert på denne protokollen (diskusjon). Denne protokollen kan enkelt tilpasses for ulike patogener og har blitt brukt i en rekke smittemodeller 6-9.
Denne protokollen er utviklet for å optimalisere transcriptional profilering for å infisere mikrober ved hjelp av en nanoString NCounter plattform. Hele prosedyren, fra vev samlingen til uttrykk data, krever mindre enn 48 timer. Hands-on tid er rundt 4 timer for 12 prøver. En sentral variabel i denne protokollen er mengden av buffer RLT lagt til vevet i den aller første skritt. For mye buffer vil fortynne homogenatet og føre til lavere RNA-konsentrasjon, mens for lite buffer kan føre til dannelse av viskøse geler etter fenol-kloroform-ekstraksjon trinn, og etterlater ingen vandig fase for gjenvinning av RNA. De empirisk bestemte optimale volumer av buffer RLT for musevev (forutsatt typiske størrelser) er: nyre (1,2 ml), tunge (1,0 ml) og lungen (2,0 ml). For mikrobielle patogener, spesielt disse dyrket i trådformede form, hjelper perle-slo skritt å bryte åpne tykk celleveggen til fullt frigjøre celleinnholdet. I elueringstrinnet, for å øke den endelige RNAkonsentrasjon, kan den første runden eluatet tilsettes tilbake til kolonnen, og eluering av en andre gang. Omtrent 100 mikrogram av total RNA vev kan gjenvinnes fra en RNeasy spinnkolonne (~ 2 ug / ul x 50 mL). Hvis større mengder RNA er nødvendig, kan en andre prep fremstilles fra den gjenværende vev homogenat. Ikke kast den gjenværende homogenate til RNA-konsentrasjon har blitt målt, bare i tilfelle.
Avhengig av infeksjonsmodell, inokulumet størrelse og patogen stamme, andelen av patogenet RNA samlet vev RNA varierer fra 0% -2%, og typisk faller innenfor 0,05% -0,5% rekkevidde. For eksempel, 10 pg av total RNA fra vev C. albicans infiserte nyre kan generere rå tellinger som tilsvarer antall 10 ng av ren C. albicans RNA fra en in vitro-kultur (10 ng / 10 ug = 0,1%). På grunn av at andelen av patogenet RNA samlet vev RNA varierer i et vidt område, er det vanskelig å vite hvor mye pathogen RNA i en gitt mengde av total RNA. For å unngå å sløse codeset (for 250 gener x 192 reaksjoner, er kostnaden per reaksjon rundt $ 200) på prøver med patogen RNA under deteksjonsnivå, kan en RNA kvalitetskontroll trinnet utføres for å bestemme patogenet RNA nivå innen hver prøve. Dette kan gjøres enten ved Q-rtPCR eller en liten kodesett som inneholdt noen få husholdningsgener.
Normalisering ved hjelp av patogene gener er et kritisk trinn før ekspresjonsprofiler kan sammenlignes mellom forskjellige prøver. Det er tre vanlige metoder for normalisering. 1. Bruk totaltellinger fra alle gener i codeset. 2. Bruk en eller noen få "housekeeping gener. 3. Bruk geometriske middel (N th roten av produktet av N tall) i høyt uttrykte gener. For en stor kodesett (> 100 gener) som inneholder tilfeldig utvalgte prober, ved hjelp av totaltellinger for normalisering kan være et godt valg, fordi de totale tellinger av et stort antall urelaterte gener kan trorepresentative mengden av RNA-inngang. For en liten kodesett (<100 gener) som inneholder prober fokusert på en bestemt prosess (som hyphal vekst, gitt at hyphal vekst gener tendens til å være co-regulert), velge ett eller noen få husholdningsgener som kontroll for normalisering er viktig. TDH3, et robust uttrykk metabolsk genet, har fungert godt som kontroll for mange eksperimenter. Den tredje metoden er en hybrid av fremgangsmåte 1 og 2, med en vekt på lik bidraget fra sterkt uttrykte gener.
Selv om NCounter plattformen ikke er genom-wide, gjør det kvantifisering av uttrykksnivået for opptil 800 gener i en enkelt analyse. Derfor velger de mest informative gener å analysere er avgjørende for suksessen til profilering. To metoder for å velge for prober er blitt brukt. Den første tilnærmingen er "kunnskapsbasert". Informasjon fra publiserte uttrykk og funksjonelle data er kompilert til skjerm for gener som er av potensiell interesse for den aktuellestudie, slik som de miljømessige responsgener 6-9. Denne tilnærmingen gir enkel sammenligning av in vivo profilering data til mange eksisterende datasett, og dermed gir kontekst til data tolkning. Den andre metode er "letebasert". En kategori av gener i en mikrobe genom, som alle genene som spesifiserer transkripsjonsfaktorer, kinaser eller cellevegg proteiner er valgt for sonder. Denne tilnærmingen gjør identifisering av nye virulensfaktorer og oppdagelsen av nye regulatoriske relasjoner basert på de vivo profilering data 6.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH tilskudd R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM & SGF), R01 AI054928 (SGF), og R01 DE017088 (SGF).
gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
Phenol:ChCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |