آخر العمود اشتقاق عن طريق رد الفعل أعمدة تدفق عالية الأداء اللوني السائل
Summary
A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.
Abstract
A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.
Introduction
عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) إلى جانب آخر عمود اشتقاق (PCD) هو أداة قوية يمكن أن يكون مفيدا في حل عدد من القضايا في المختبر التحليلي. ويمكن استخدامه للكشف عن المركبات التي لا يمكن اكتشافها إلا مع مجموعة من أجهزة كشف المتاحة 1،2، وزيادة إشارة الحليلة الهدف، والذي يسمح الحدود الدنيا للكشف وتحديد الكميات 3-5 أو انتقائي derivatize على الحليلة المستهدفة من أجل تجنب آثار مصفوفة 6. وتشمل يشيع استخدامها ردود الفعل PCD رد فعل الأمينات، مثل الأحماض الأمينية، مع أورثو-phthaladehyde 7-9، النينهيدرين 9،10 أو fluorescamine 11،12، واشتقاق من أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) لدى ديفينيل 2،2 1-picrylhydrazil المتطرفة (DPPH •) 13،14 أو 2،2'-azino مكرر (حمض 3-ethylbenzothiazoline-6-السلفونيك (ABTS) 15،16، واستخدام كاشف يوديد-أزيد إلى derivatize الكبريت جمركبات ontaining 17،18.
هناك، ومع ذلك، العديد من المآخذ على استخدام ردود الفعل PCD مع أنظمة HPLC 6. أساسا بين هذه هو استخدام لفائف رد فعل بين نقطة إضافة كاشف اشتقاق (ق) وكاشف، مما يتيح الوقت لخلط ورد فعل لتحدث 8. هذه رد فعل الحلقات غالبا ما يكون حجم 500 ميكرولتر أو أكثر، وهو أمر مهم مقارنة مع حجم ما تبقى من نظام HPLC 19. استخدام هذه ارتفاع حجم رد الفعل حلقات النتائج في زيادة الذروة توسيع بالمقارنة مع ما سيتم الاحتفال به بدون وجود حلقة رد فعل. هذه النتائج في أقصر، قمم الأوسع نطاقا التي لها حدود أعلى من الكميات والكشف وسلبيا يؤثر قرار الكروماتوغرافي. أرقام 1 و 2 تسليط الضوء على تدهور ذروة الشكل الذي ينتج من إضافة المختلفة بعد العمود كميات رد فعل حلقة. هذا التحليلوقد أجريت مع تكوين مرحلة المحمول من 94٪ الميثانول و 6٪ من المياه الملة-Q. وكان معدل تدفق الطور المتحرك 1 مل / دقيقة، وكان حجم حقن 20 ميكرولتر وكان الطول الموجي تحليل 265 نانومتر. أدرجت لفائف من مختلف أحجام الميتة من 20 ميكرولتر إلى 1000 ميكرولتر بين العمود وكاشف لمحاكاة آثار رد فعل حلقة حجم القتلى في أساليب PCD. تم إعداد هذه الحلقات من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها الداخلي 0.5 ملم. تم إجراء تجربة على نظام HPLC تتكون من وحدة تحكم (SCL-10AVP)، وانخفاض ضغط متدرجة صمام (FCL-10ALVP)، مضخة (LC-20AD)، والحاقن (SIL-10ADVP)، وكاشف المساعد الشخصي الرقمي ( SPD-M10ADVP). تم ضخ الطور المتحرك من خلال الغاز الراحل قبل إدخالها في نظام HPLC. تم إجراء فصل باستخدام س 4.6 ملم معرف 5 ميكرون العمود 250 ملم. وقد تم اختيار الظروف التجريبية لتكون نموذجية من ردود الفعل PCD أن تم مؤخرا نشرت في الأدب.
الأبسط، ويطلق آخر الأكثر شيوعا الإعداد مفاعل العمود مفاعل أنبوبي غير مجزأة والتي هي بالفعل طويلة، أنبوب رفيع من خلالها السائل يمكن أن تتدفق ورد فعل يمكن أن يحدث. في هذه الذروة نظام توسيع يعتمد على ليس فقط حجم القتلى إضافتها إلى النظام، ولكن أيضا القطر الداخلي للأنبوب نحو ما أبرزته إيجيما وآخرون. 8. وعلاوة على ذلك، لفائف الهندسة تلعب دورا في توسيع العلامة التجارية لوحظ. ستيوارت 20 ذكر أن اللف المفاعل يغير ملامح تدفق الثانوية، مما أدى إلى أفضل خلط، وهذا يعني أن حجم القتلى قد يكون الحد الأدنى. وقد ذكر أن ذروة توسيع ليس كبيرا عند استخدام أنبوبي مفتوحة محبوك لفائف 21. عندما ذروة توسيع هو كبير جدا، ويمكن أيضا اعتبار أنواع أخرى من المفاعلات 20،22. ويمكن أن تشمل هذه المفاعلات السرير أو مفاعلات تدفق مجزأة. هذه المفاعلات هي مفيدة بشكل خاص لردود الفعل البطيئة التي من شأنها أن اشتراطات غير ذلكحلقات رد فعل ه كبير. كما المفاعلات الأنبوبية غير مجزأة هي الأنواع الأكثر شيوعا من المفاعلات المستخدمة في التطبيقات PCD، والباقي من هذه الصفقات المادة مع هذا النوع من الإعداد المفاعل.
تصميم العمود تدفق رد فعل (RF) يشتمل على نهاية المناسب متعددة المنفذ الذي يسمح الطور المتحرك للخروج (أو دخول) العمود إما من خلال منفذ واحد يقع في المنطقة المركزية الشعاعية للعمود أو ثلاثة الموانئ الواقعة على الخارجي منطقة جدار العمود (انظر الشكل 3). يتم فصل هذين التيارين باستخدام المناسب نهاية تحتوي على فريت التي يسهل اختراقها المركزي الذي تحيط به حلقة كتيمة التي هي بدورها محاطة فريت التي يسهل اختراقها الخارجي الذي يمتد إلى جدار العمود. بسبب تدفق حلقة عبر المركزي كتيمة غير ممكن بين المناطق التي يسهل اختراقها اثنين.
خلال رد فعل اللوني التدفق، وضخ كاشف اشتقاق (ق) ضد اتجاه تدفق مرحلة المحمول إلى واحد أو TWس من الموانئ الخارجية للعمود تدفق رد فعل. يتم خلط شاطف عمود مع كاشف اشتقاق (ق) في فريت الخارجي وتمريرها إلى كشف من خلال منفذ خارجي خال. يمكن استخدام تدفق رد فعل إما لاشتقاق كاشف واحد (1 منفذ للكاشف اشتقاق، 1 منفذ لتمرير شاطف العمود إلى كشف و 1 منفذ سدت) أو نظام كاشف المزدوج (2 الموانئ لالكواشف اشتقاق و 1 منفذ ل تمرير شاطف العمود إلى كاشف). إما أن تدفق من التيار المركزي أن تستخدم للكشف عن شاطف العمود underivatized وفعالية الكشف عن الإرسال المتعدد 23، أو تمريرها إلى النفايات.
أسلوب واحد ضبط الرئيسية المتوفرة عند تشغيل RF-PCD اللوني هو نسبة التدفقات المركزية والطرفية. النسبة المثلى لكل اشتقاق يعتمد على عدد من العوامل مثل ما إذا كان سيتم الكشف عن تدفق المركزي أو تمريرها إلى النفايات. لذلك مرة واحدة وقد تم تحديد النسبة المثلىيجب التأكد من أن نسبة تدفق الصحيحة يتحقق قبل كل تشغيل التي يتم تنفيذها.
وقد وجد أن استخدام فريت لخلط تيار العمود شاطف وكاشف اشتقاق في نتائج RF-PCD في خلط أكثر كفاءة مقارنة مع تقنيات خلط التقليدية التي عادة ما تستخدم صفر حجم القتلى T-قطعة أو حجم القتلى منخفض W- قطعة لمزيج من التيارين. وقد سمح ذلك لاستخدام الحلقات رد فعل صغيرة نسبيا، أو حتى القضاء على حلقة رد فعل تماما. الحد من نتائج رد الفعل حجم حلقة في قمم أكثر وضوحا بالمقارنة مع الطرق التقليدية اشتقاق آخر عمود. وهذا يعني أنه على الرغم من حقيقة أن ليس كل من شاطف عمود وderivatized، لوحظ أكبر إشارة إلى نسب الضوضاء وحدود وبالتالي أقل الكشف والكميات لا يمكن أن يتحقق.
وقد وضعت تدفق رد فعل اللوني للتغلب على الصعوبات مع التكيف من رد فعل PCD الصورة الأعمدة الحديثة HPLC والأنظمة، لا سيما الخسارة في الكفاءة الناجمة عن الفرقة توسيع بسبب آخر عمود كميات كبيرة ميتة الناجمة عن الحاجة إلى توظيف رد الفعل حجم كبير حلقات. عمليات خلط أكثر كفاءة في RF-PCD مقارنة PCD التقليدي يعني أن أحجام التداول حلقة رد فعل أصغر قد تكون عاملة مما يؤدي إلى زيادة في كفاءة الفصل المرصودة. وعلاوة على ذلك يظهر RF-PCD اللوني على حد سواء زيادة إشارة وانخفاض الضوضاء بالمقارنة مع التقنيات التقليدية PCD مما أدى إلى الحدود الدنيا من الكشف والكميات بالمقارنة مع الطرق التقليدية PCD. ميزة إضافية لRF-PCD بالمقارنة مع الطرق التقليدية PCD هي القدرة على رصد تيار underivatized أن elutes من الميناء الرئيسي للعمود RF فضلا عن تيار derivatized أن elutes من المنطقة الطرفية من العمود. RF-PCD هي تقنية جديدة نسبيا ولكنها واعدة أن يعرض مزايا عديدة أكثر من الطرق التقليدية PCD.
<p class="jove_content"> ويتحقق اتصال العمود RF في تقريبا بنفس طريقة عمود HPLC التقليدية مع فارق كبير يجري عدد من التجهيزات نهاية على عمود RF. التجهيزات المستخدمة لربط عمود HPLC القياسية لنظام HPLC هي قادرة على أن تستخدم لربط عمود الترددات اللاسلكية لنظام HPLC.Protocol
Representative Results
Discussion
RF-PCD يسمح لخلط الفعال للكاشف اشتقاق مع النفايات السائلة بعد عمود HPLC دون استخدام لفائف رد فعل، والتقليل من آثار توسيع نطاق وتحسين أداء الانفصال. وقد أظهرت أساليب RF-PCD أيضا التحسينات في الاستجابة إشارة فيما يتعلق طريقة الكشف. كان Camenzuli وآخرون. 28 أول من أشار إلى…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
Materials
| HPLC instrument | Agilent | 1290 Series HPLC | |
| Additional Pump(s) for derivatisation system | Shimadzu | LC-20A | |
| RF colum | Non-commercial | ||
| PEEK tubing | Sigma Aldrich | Z227307 | |
| Column stoppers | Provided with column | ||
| PEEK tube cutter | Sigma Aldrich | Z290882 | |
| Analytical Scale Balance | 4-point analytical balance | ||
| Stop watch | Non-Scientific equiptment | ||
| Eluent collection vials | Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials | ||
| HPLC Vials | Will depend on instrument used | ||
| Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s) | Sigma Aldrich | Z232211 | |
| General Laboratory glassware | Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method | ||
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| DPPH | Sigma Aldrich | D9132 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | 17836 | |
| Ammonia | Sigma Aldrich | 320145 | Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Fluorescamine | Sigma Aldrich | F9015 | |
| 4-aminoantipyrene | Acros Organics BVBA | AC103151000 | |
| Potassium ferricyanide | AnalaR | B10204-30 |
Referências
- Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
- Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
- Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
- Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
- Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
- Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
- Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
- Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
- Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
- Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
- Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
- Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
- Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
- Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
- Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
- Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
- Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
- Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
- Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
- Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. , (2015).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
- Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
- Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
- Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).
