反応フロー高速液体クロマトグラフィー用カラムを使用したポストカラム誘導体化

Summary

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Abstract

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Introduction

ポストカラム誘導体化（PCD）と結合された高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、分析研究室で多くの問題を解決するのに有用である強力なツールです。これは、利用可能な検出器^1,2のスイートとさもなければ検出不能である化合物を検出し、選択的検出および定量^3-5の下限を許可または標的分析物のシグナルを増加させることができることを避けるために、標的分析物を誘導体化マトリックス効果^6。一般的に使用されるPCD反応は^、9,10またはフルオレサミン^11,12ニンヒドリン、2,2-ジフェニルと反応性酸素種（ROS）の誘導体をオルト-フタルアルデヒド^7-9を有するアミノ酸などのアミンとの反応を含みます1- picrylhydrazilラジカル^{（DPPH•）13,14、}または2,2'-アジノ-ビス（3-ethylbenzothiazoline -6-スルホン酸^{（ABTS）15,16、}および硫黄cを誘導体化するためにヨウ化アジド試薬の使用ontaining化合物^17,18。

HPLCシステム⁶を有するPCD反応の使用には多くの欠点は、しかし、存在します。主にこれらの間混合し^、8を発生するための反応時間を可能にする誘導体化試薬（単数または複数）の添加の時点と検出器との間の反応コイルの使用です。これらの反応は、多くの場合、HPLCシステム¹⁹の残りの部分の容積に比べて有意である500μlあるいはそれ以上の容積を有するループ。これらの大量の反応の使用は、反応ループの存在なしで観察されるものと比較して増加したピークの広がりをもたらすループ。これは、定量および検出の高い限界が短く、幅の広いピークになると負のクロマトグラフィー分解能をもたらす。1および図 2は 、様々なポストカラム反応ループのボリュームの追加に起因するピーク形状の悪化を強調表示します。この分析94％メタノールおよび6％のMilli-Q水の移動相組成を用いて行きました。移動相の流速は1ml /分であり、注入量は20μlであったと分析波長は265 nmでした。千μlに20μlのからデッドボリュームを変化させるコイルはPCD法における反応ループデッドボリュームの影響をシミュレートするために、カラムと検出器との間に挿入しました。これらのループは、0.5 mmの内径のステンレス鋼管から調製しました。実験は、コントローラ（SCL-10AVP）からなるHPLCシステム上で実施した、低圧グラジエントバルブ（FCL-10ALVP）、ポンプ（LC-20AD）、インジェクター（SIL-10ADVP）、およびPDA検出器（ SPD-M10ADVP）。移動相は、従来のHPLCシステムに導入する脱気装置を通してポンプ輸送しました。分離250ミリメートル×内径4.6 mm 5ミクロンカラムを用いて行きました。実験条件は、最近、文献に発表されているPCD反応の典型であるように選択しました。

ザ最も簡単なのは、最も一般的なポストカラム反応器の設定は、効果的に液体を流すことができ、反応が起こることができ、それを通して細長いチューブである非セグメント管状反応器と呼ばれます。このシステムピークに広がりがないだけで、システムに追加デッドボリュームだけでなく、飯島ら ⁸によって強調されているように、管の内径に依存しています。また、コイル形状が観察されたブランドの広がりで役割を果たしています。スチュワート^20は、反応器の巻取りがデッドボリュームを最小化することができることを意味し、より良好な混合が得られ、二次流れのプロファイルを変更することを述べました。 ²¹コイルニット開管を使用するときにピークの広がりが重要ではないことを述べました。ピークの広がりが大きすぎる場合は、反応器の他のタイプも^20,22と考えることができます。これらは床反応器またはセグメント流反応器を含むことができます。これらの反応器は、そうでなければrequirだろう遅い反応のために特に有用です電子大きな反応がループします。非セグメント化された管状反応器は、PCDのアプリケーションで使用される原子炉の中で最も一般的なタイプであるため、この記事の残りの部分は、反応器のセットアップのこのタイプを扱います。

反応流（RF）列の設計は、移動相が外側に位置し、半径方向の中央列の領域または3のポートに配置された単一のポートのいずれかを介してカラムを出る（または入力）することを可能にするマルチポートエンドフィッティングを組み込んカラムの壁領域（ 図3参照 ）。これらの二つの流れを順番にカラム壁に張り出し、外側多孔質フリットに囲まれている不透過性のリングに囲まれている中央の多孔質フリットを含むエンドフィッティングを用いて分離されています。中央不透過性リングクロスフローに2多孔性領域の間では不可能です。

反応流クロマトグラフィーの間に、誘導体化試薬（複数可）は一つ又はTWに移動相の流れ方向に対してポンピングされます反応流列の外側ポートのO。カラム溶出液は、外側のフリットで誘導体化試薬（複数可）と混合し、無料の外側ポートを介して検出器に渡されます。反応流は、単一の試薬誘導体（誘導体化試薬のための1ポート、1ポートは、検出器とブロックされた1ポートに、カラム溶離液を通過させるように）またはデュアル試薬系誘導体化試薬とを1ポート（2ポートのいずれかのために使用することができます）検出器にカラム溶離液を通過させます。中央ストリームからの流れは、いずれかの誘導体化されていないカラム溶離液、効果的に多重化検出^23、または無駄に渡さを検出するために使用することができます。

RF-PCDクロマトグラフィーを実行するときに利用可能である一つの主要なチューニング技術は、中央と周辺の流れの比率です。各誘導体化のための最適な比率は、中央フローが検出されたり無駄に渡されるかどうかなど、多くの要因に依存します。したがって、最適な比率が決定された後正確な流量比は、各ランが実行される前に達成されることが保証されるべきです。

フリットの使用が一般的にゼロデッドボリュームのTピースまたは低デッドボリュームを採用し、従来の混合技術と比較して、より効率的な混合でRF-PCD結果の列溶離液流と誘導体化試薬を混合することが見出されていますW-作品は、2つのストリームを混合します。これは、比較的小さな反応ループの使用、または全く反応ループのさえ排除を可能にしました。伝統的なポストカラム誘導体化法に比べてシャープなピークで反応ループサイズの結果の減少。これは、全てのカラム溶離液のが誘導体化されるという事実にもかかわらず、対雑音比より高いシグナルが観察され、したがって検出及び定量化の下限を達成することができる、ということを意味します。

反応流クロマトグラフィーは、PCD反応の適応の困難を克服するために開発されました現代のHPLCカラムやシステムへの、による大容量の反応ループを採用する必要性に起因する大規模なポストカラムデッドボリュームに広げるバンドに起因する効率の特に損失。従来のPCDと比較して、RF-PCDで、より効率的な混合プロセスは、より小さな反応ループ量が観測された分離効率の上昇につながる使用されてもよいことを意味します。さらに、RF-PCDクロマトグラフィーは両方の増加したシグナルを示し、従来のPCD法に比べて検出および定量の下限をもたらす従来のPCDの技術に比べ、ノイズを減少させました。従来のPCD法に比べてRF-PCDのさらなる利点は、RF列の中央のポートだけでなく、列の周辺領域から溶出する誘導体化されたストリームから溶出する非誘導体化ストリームを監視する機能です。 RF-PCDは、従来のPCDの方法に比べて多くの利点が表示され、比較的新しいが、有望な技術です。

<p class="jove_content"> RF列の接続は大きな違いは、RF列の端金具の数であると従来のHPLCカラムとほぼ同じ方法で達成されます。 HPLCシステムに標準的なHPLCカラムを接続するために使用される継手は、HPLCシステムへRF列を接続するために使用されることが可能です。

Protocol

注意：（ すなわち 、メタノールのためのMSDS）は、使用する前に、すべての材料および試薬のための材料安全データシート（MSDS）をご参照ください。溶剤および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を溶離液を取り扱うときは、すべての適切な安全対策を使用することを確認してください。 HPLC、分析天びんと検出器計測器の技術的管理の適切な使用を確保し、個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、…

Representative Results

RF-PCDによる使用のために適合された第一のPCD法は、2,2-ジフェニル-1- picrylhydrazilラジカル（DPPH•）24を用いて、酸化防止剤の誘導体でした。この反応は、25。コーレバらによって導入された、広く以来使用されています。検出は、活性酸素種の存在下でDPPHラジカル•の脱色、観察された吸光度の低下で抗酸化物質の結果のそれ故に存在に?…

Discussion

RF-PCDは、バンドの広がりの影響を最小化し、分離性能を向上させる、反応コイルを使用することなくHPLC廃液ポストカラムで誘導体化試薬の効率的な混合を可能にします。 RF-PCD法はまた、検出方法に対する信号応答の改善を示しています。 Camenzuli ら ^28は、エスプレッソコーヒー、試料中のROSの検出のための^DPPH•との反応流列の使用を初めて報告しました。彼らの研究…

Materials

HPLC instrument	Agilent	1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatisation system	Shimadzu	LC-20A
RF colum			Non-commercial
PEEK tubing	Sigma Aldrich	Z227307
Column stoppers			Provided with column
PEEK tube cutter	Sigma Aldrich	Z290882
Analytical Scale Balance			4-point analytical balance
Stop watch			Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials			Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials
HPLC Vials			Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)	Sigma Aldrich	Z232211
General Laboratory glassware			Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method
Methanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	17836
Ammonia	Sigma Aldrich	320145	Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4-aminoantipyrene	Acros Organics BVBA	AC103151000
Potassium ferricyanide	AnalaR	B10204-30