Préparation de thermosensible surfaces nanostructurées pour l'ingénierie tissulaire
Summary
Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.
Abstract
Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.
Introduction
surfaces nanostructurées ont récemment attiré une attention considérable en raison de leurs diverses applications potentielles, y compris les motifs, la culture cellulaire, le nettoyage et la commutation de surface. Par exemple, les surfaces superhydrophobes inspirées par la nanostructure de la feuille de lotus et d' autres surfaces sensibles sont capables de réagir à des stimuli externes 1-4.
Le film de Langmuir est l'un des revêtements les polymères les plus étudiés. Un film de Langmuir est formé en déposant des molécules amphiphiles sur une interface air-eau 8/5. Le film peut alors être transféré sur une surface solide par adsorption physique ou chimique, et la conformation moléculaire sur une surface solide peut être contrôlée en utilisant des procédés de transfert vertical et horizontal 9-12. La masse volumique du film de Langmuir peut être régulée avec précision par compression de l'interface air-eau. Récemment, cette méthode est également avéré efficace pour la fabrication nanométriques structur mer-îlees en utilisant des copolymères à blocs amphiphiles. Les nanostructures sont supposés consister en un noyau de segments hydrophobes et une enveloppe de segments hydrophiles 13-17. En outre, le nombre de nanostructures sur une surface est régulée par le contrôle de la surface par molécule (A m) du copolymère séquencé à l'interface.
Nous nous sommes concentrés sur un original, d'un tissu approche unique d'ingénierie sans échafaudage, l'ingénierie de la feuille cellulaire, en utilisant une surface de culture sensible à la température. La technologie développée a été appliquée à des thérapies régénératrices pour divers organes 18. Une surface de culture sensible à la température a été fabriquée par greffage de poly (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), une molécule sensible à la température, sur une surface de 19 à 27. PIPAAm et ses copolymères présentent une température de solution critique inférieure (LCST) en milieu aqueux à des températures proches de 32 ° C. La surface de culture a également présenté une alternati sensible à la température entre le caractère hydrophobe et le caractère hydrophile. À 37 ° C, la surface PIPAAm greffée est devenu hydrophobe, et des cellules facilement attaché et prolifèrent sur la surface, ainsi que sur le polystyrène classique de culture tissulaire. Lorsque la température a été abaissée à 20 ° C, la surface devient hydrophile, et les cellules spontanément détaché de la surface. Par conséquent, les cellules confluentes cultivées sur la surface peuvent être récoltées comme une feuille intacte en changeant la température. Ces propriétés d'adhérence cellulaire et de détachement sont également affichées par une surface fabriquée par Langmuir revêtement de film pour le laboratoire de démonstration 26, 27. Un film de Langmuir de copolymères à blocs constitués de polystyrène (P (St)) et PIPAAm (St-IPAAm) a été fabriqué. Le film de Langmuir avec spécifique A m peut être transféré horizontalement sur un substrat en verre modifié hydrophobiquement. En outre, l'adhésion cellulaire sur et le détachement de la surface préparée en réponse à la température ont été évalués.
_content "> Ici, nous décrivons les protocoles pour la fabrication d'un film de Langmuir nanostructuré composé de copolymères à blocs amphiphiles thermo-réactif sur un substrat de verre. Notre méthode peut fournir une technique de fabrication efficace pour nanofilms organiques dans divers domaines de la science des surfaces et peut faciliter plus un contrôle efficace de l'adhérence cellulaire et sur le détachement spontané d'une surface.Protocol
Representative Results
Discussion
Une surface sensible à la température a été fabriquée par le procédé de Langmuir-Schaefer et les propriétés de surface pour l'adhérence cellulaire / détachement et une feuille de recouvrement cellulaire ont été optimisées. Lors de l'utilisation de cette méthode pour la fabrication de surfaces, plusieurs étapes sont critiques. La composition moléculaire des molécules St-IPAAM a un effet important sur la structure de la surface et la stabilité de la surface, et par extension, sur l'adhérenc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Creation of Innovation Centers for Advanced Interdisciplinary Research Program’s Project for Developing Innovation Systems “Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)” of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT), Japan.
Materials
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
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