Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
التقاط كميا العمليات التنموية أمر بالغ الأهمية لاستخلاص النماذج الميكانيكية والمفتاح لتحديد ووصف الظواهر متحولة. هنا يتم عرض بروتوكولات لإعداد الأجنة وC. الكبار ايليجانس الحيوانات لقصيرة وطويلة الأجل الوقت الفاصل بين المجهر وطرق تتبع وتقدير من العمليات التنموية. الأساليب المقدمة تستند فقط على C. سلالات ايليجانس المتاحة من مركز علم الوراثة انواع معينة وعلى البرمجيات مفتوحة المصدر التي يمكن تنفيذها بسهولة في أي مختبر مستقل عن نظام المجهر المستخدمة. A إعادة بناء نموذج 3D خلية الشكل باستخدام IMOD نماذج البرمجيات، وتتبع اليدوي الهياكل التحت خلوية fluorescently المسمى باستخدام متعددة الأغراض برنامج تحليل الصور Endrov، وتحليل تدفق مقلص القشرية باستخدام PIVlab (حل الزمن الرقمي الجسيمات صورة Velocimetry وأظهرت أداة لMATLAB). تم مناقشته كيف يمكن أيضا أن يتم نشر هذه الأساليب رس التقاط كميا العمليات التنموية الأخرى في نماذج مختلفة، على سبيل المثال، تتبع الخلايا والنسب تتبع، تتبع تدفق الحويصلة.
مع التحسن المطرد من البروتينات الفلورية، والهندسة الجينية، المجهر الضوئي، والبرنامج التشغيلى الكمبيوتر والأجهزة، أصبح من الممكن الآن لتسجيل تطوير العديد من الكائنات النموذجية في القرار المكانية والزمانية لم يسبق له مثيل. هذا يسمح للباحثين لطرح الأسئلة التي لا يمكن معالجتها سابقا أو لإعادة النظر في العمليات التنموية المعروفة من أجل البحث عن الجوانب تجاهلها. وأثار هذا التقدم في مجال البيولوجيا التطورية الكمي، الذي يهدف إلى تحويل، ونماذج رسمية النوعية في النماذج الكمية التي كتبها قياسات دقيقة والتحليلات الإحصائية.
جعلت خلايا تتبع والهياكل التحت خلوية من الممكن استخلاص النماذج الكمية من التطور الجنيني، نشاط الجهاز العصبي، أو انقسام الخلايا 12/01. من خلال تتبع بقايا انقسام الخلايا خلال التنمية في وقت مبكر من C. ايليجانس الجنين، يمكن أن تكشف مؤخرا أنها تتبع جهاز ستيريوعوامل كتبته مسار ويشكل الاستقطاب المهم 13،14.
هنا، يتم عرض البروتوكولات التي تجعل النهج البيولوجيا التطورية الكمي للوصول لغير الخبراء. التركيز يكمن في ثلاث على التوالي إلى الأمام، والأدوات المتاحة بحرية التي يمكن أن تنفذها في أي مختبر لديه حق الوصول إلى معيار المجهري متحد البؤر وأجهزة الكمبيوتر. وتشمل هذه بروتوكول لتوليد الأشكال خلية 3D، وبروتوكول لتعقب فلول انقسام الخلايا، وبروتوكول لوصف كميا ديناميات أكتوميوزين القشرية. الديدان الخيطية C. يستخدم ايليجانس كحالة نموذجية، ومع ذلك، فإن أساليب وأدوات مناقشتها هنا هي مناسبة لمجموعة متنوعة من الأسئلة في النماذج البيولوجية الأخرى، على سبيل المثال، الخلايا المستزرعة، إإكسبلنتس الأنسجة، organoids أو الكروية والأجنة الأخرى، الخ
عموما، بعض التحليلات هو موضح هنا يمكن أيضا أن يؤديها مع شعبية مفتوحة المصدر أداة يماغيج (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.أتش تي أم أل. أو في فيجي، "وشملت بطاريات" إصدار يماغيج، http://fiji.sc/Fiji) التي هي العديد من الإضافات للالتحليلات الكمية المختلفة المتاحة. ومع ذلك، فإن برامج مناقشتها هنا مصممة لمعالجة مشاكل محددة.
أولا، IMOD، ومعالجة الصور، والنمذجة وعرض جناح يمكن استخدامها لإعادة بناء 3D من مسلسل أقسام من الإلكترون المجهري أو ضوء 15. كما يحتوي IMOD أدوات للعرض البيانات 3D من أي اتجاه. ثانيا، Endrov، وهو برنامج جافا المصممة لإجراء تحليل الصورة، ومعالجة البيانات، والشرح الشبكات أو المسارات (وغيرهم) على أساس العمارة المساعد طويلة، مع يماغيج المساعد التوافق 16. أنه يحتوي على أكثر من 140 عمليات لمعالجة الصور واجهة المستخدم الموسعة التي يتم فيها عرض النماذج والبيانات الخام على حدة. ويمكن الاطلاع على شفرة المصدر في https://github.com/mahogny/Endrov. ثالثا، PIVlab، وMأداة ATLAB عن الجسيمات الصور الرقمية velocimetry التي تسمح للمستخدم لكميا ونوعيا تحليل حقول تدفق الجسيمات 17. استخدام هذه البرامج يتطلب ترخيص MATLAB الذي يتضمن أدوات معالجة الصور (http://mathworks.com). PIVlab هو برنامج مصمم لوصف تدفق كميا. وتحسب توزيع سرعة وحجم، الدردورية، الاختلاف، أو القص ضمن أزواج صورة أو سلسلة. لهذا، فإنه عبر يرتبط مناطق صغيرة من الصور (وتسمى 'يمر' في قسم البروتوكول) من الزوج الصورة لاشتقاق النزوح الجسيمات الأكثر احتمالا. هذا الارتباط عبر ينتج مصفوفة الارتباط التي يمكن تحليلها في مجال الفضاء أو التردد باستخدام إما مباشرة عبر ارتباط أو تحول فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس)، على التوالي.
المعدات المستخدمة هنا هي مجهر مقلوب مجهزة نيبكو ('الغزل') القرص، وهو EMCCD، 488 و 561 نانومتر solid- القياسيةليزر الدولة، و20x والهواء أو 40X 60X أو خطة / امزيغ أهداف بالنفط أو الغمر بالمياه. ومع ذلك، فمن الممكن أيضا أن أداء الوقت الفاصل بين التصوير مع طرائق التصوير الأخرى، على سبيل المثال، راهنا، line- أو القائم على الليزر المجهر رقة المسح الضوئي، متعدد الفوتون المجهري، وكذلك برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر جنبا إلى جنب مع deconvolution أو منظم إضاءة. وميزة استخدام نظام القرص نيبكو هي الحصول على الصور سريع للغاية، وخاصة إذا وضع تدفق (حركة مستمرة والمسح الضوئي للجسم في البعد ض) هو متاح. بالإضافة إلى ذلك، لتحسين القرار، مكبرة الموسع 1.5 أضعاف أمام EMCCD يمكن استخدامها.
من خلال تتبع الكائن في التنمية ولا سيما تتبع النووي، كان، فإنه من الممكن توضيح الآليات الزخرفة المركزية للC. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني 1،23،24. توسيع هذه الاستراتيجية إلى ارتفاع الإنتاجية، فقد كان من الممكن مؤخرا للكشف عن قواعد الزخرفة إضافية واقتراح ال…
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
20 µm | |||
Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
0.1 µm | |||
Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |