Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.
Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.
近年来色谱柱技术的高效液相色谱法(HPLC),极大地推进;峰容量大大增加在很大程度上要归功于使用更小的颗粒尺寸和更高效的核壳粒子。因为分离通常是更有效的,因为峰现在更清晰,因此高1-8的流上作用已在敏感性的增加。
然而,径向床异质仍然在所有列的性能的一个限制因素,但是这不是一个新的故事,因为色谱已经知道这个多年。柱床有两个沿径向9-12异类,和沿列轴10,12-15。壁效应尤其是分离性能7,16-18损失的一个重要因素。 Shalliker和Ritchie 7最近审查柱床异质性方面,因此这不一定是discusseð这里进一步。虽然我只想说,在柱床堆积密度和变化的壁效应导致溶质插头的扭曲,使得乐队通过列塞类似于部分填充汤洗脱碗,而不是薄平固盘7通常是在基础教学文本描述。当实验进行,使得通过该床的溶质迁移可以被可视化的柱内的插头剖面是部分中空和带的拖尾部分主要是样品插头的壁组件。最终的结果是,它需要更多的板,以隔开比如果盘是固体和平面12,14,17将需要这些“部分空心'插头。为了克服乐队扩大与壁效应和径向填充密度的变化有关的问题,被称为主动流动技术(AFT)柱技术的一种新形式的设计7,19。这种设计的目的是通过溶剂洗脱的沿着壁区域中的物理分离除去壁效果,从该流动相在柱19的径向中心区域洗脱。有两种主要类型的AFT列;并行分段流动(PSF)列和窗帘流量(CF)7列。由于该协议的目的是CF列的使用和优化,PSF列将不作进一步讨论。
幕流(CF)
幕流(CF)柱格式利用在两个入口和柱的出口AFT端部附件。 AFT端部附件包括位于一个多件内的环形熔块。玻璃料是由三部分组成:与端部的中心孔嵌合,与该端部接头的外周端口对准的多孔外部部分,和一个不渗透环对准的多孔径向中央部,其分离防止任何交叉的两个多孔部分玻璃料19的径向中心和外部区域之间-flow。 图1示出的AFT玻璃料的设计与图2示出在CF列格式。在此模式下操作的(CF)的样品被注入到入口配件的径向中央端口,而额外的移动相通过的径向中心区域通过所述入口到“帘”溶质的迁移的圆周口导入柱。因此,样品进入与具有流动相仅通过它的列的外部区域的列的径向中心区域的床。有研究表明,大约40:60的体积流率比(中央:周边端口),用于在入口4.6内径(ID)柱的端部配合的是最佳的6,7,16。在CF塔的AFT出口允许中枢和外周流量的调节其相对部分,并且可以被改变以几乎任何期望的拉提通过压力管理o。在CF列的优化可以显著改善塔技术的各种功能方面,例如分离效率或检测灵敏度。以这种方式,“无壁”,“无限直径”或“虚拟”列建立6,10,18,20。 CF列的目的是为了通过该柱主动管理样品的迁移,以防止样品在到达壁区域。因此,在出口到检测器中的溶质浓度为最大,当使用紫外线(UV)检测16,以及即使使用质谱检测6时更大的增加的比常规列格式更大约2.5倍的灵敏度。
CF列非常适合于低浓度的样品中,由于检测灵敏度增加。此外,联接到流率受限探测器,诸如质谱仪(MS)的6时它们是理想的。一个AFT柱在4.6毫米内径的格式,例如可以调整为标准2.1 mm内径格式列时在同一线速度操作时,通过调整中央流动退出到21%,提供的溶剂相同体积到检测器。同样,AFT列也可以调整,通过调整核心流程退出到43%,提供相同的容积负荷的检测器,3.0 mm内径柱。事实上任何“虚拟”列格式可以生产以满足需求分析6,18,22。在入口使用这些专门设计的端部附件和出口确保真正的无壁列成立。
有两种方法来设置溶剂输送系统入口的中心和周边港口:分流系统6和两个泵系统6,7 图3说明每个CF系统设置窗口中。
分流系统
一世呐分流系统( 图3A)的泵的流量通向喷射器是使用零死体积T型件,其中流动相的一个流动流被连接到喷射器,其然后连接到分裂预喷射柱的入口端,嵌合的中央端口。流动相的第二流动流通过绕过喷射器,并连接到外围端口上的柱的入口。中流动的分割,在流动流百分比调节至40:60(中心:外围设备)的线连接到列之前, 即从喷射器到中心和泵外围。
双泵系统
在CF列需要在塔的入口端拟合两个流动流。根据高效液相色谱仪,分流设置的自动进样器/喷射器的类型,可能无法进行,所以CF然后可以通过两个泵( 图3B 21)来实现。每个泵被分配,选择连接到中央或外围端口和流率被设定为表示流量为中央口的40%,为外围端口60%。例如,如果总流速1.0毫升分钟-1,中央泵流量被设为0.4毫升分钟-1和外围泵被设置为0.6毫升分钟-1。
其中操作方式的选择在很大程度上取决于该HPLC仪器和操作色谱模式。例如,在一些自动进样器中的样品装载位置和样品之间的压力的变化注入,可能会发生位置扰乱分流比,因此在这种情况下,一个双泵设置将被推荐为最佳的CF性能。无论设置溶剂输送系统选择用于CF柱的入口,在CF出口优化保持相同。在CF柱出口中央端口附连到与SMAL的紫外可见(UV-VIS)检测器免得体积可能管以减少柱后死体积的影响。因为,CF列模拟窄径柱,柱出口和检测器之间的死体积是不利的CF柱的分离性能。关键是要确保中央端口和UV-Vis检测以减少死体积的如带展宽,损失在效率和灵敏度的影响之间管容积的最小量。因此,使用窄口径管材(0.1毫米)的建议,以轻易让调整的压力不增加不适当的死体积。管也连接到所述外围端口,并指示浪费。当在CF柱的出口,所述分割比可以调节到适合分析者的目的的任何比率。当使用4.6 mm内径的CF,例如,它常常是方便设置的比率为要么43:57或21:79(中心:周),以模拟一个“虚拟”3.0毫米内径柱或2.1毫米内径柱,尊敬。这样的分离性能是容易长凳标记。分割比由称重流从连接到中央端口和流动离开该外围端口经过一段时间的检测器排出的量来测量。的百分比流量通过每个端口可以被确定,并且该比率可以通过改变管附着的长度或用具有不同的内部直径(ID)管进行调整。
此视频协议细节增强色谱性能CF塔的运行和优化程序。
这项研究涉及CF色谱柱的实验室间分析测试效率和灵敏度方面的分析性能。在CF柱在节'3的描述设置了双泵系统。双泵系统设定“来实现的40:60的流量比:在CF柱的入口(中心周)。的40:60(中心:外设)流量比通过设定各泵分别代表40%,总流量的60%,该值的流率实现的。在CF塔出口用以下在部分“中描述的方法调谐到为2.1毫米的ID的”虚拟“塔4。 CF出口流量的调整“。使用含有苯乙醚,丁基苯…
The authors have nothing to disclose.
One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
HPLC instrument | |||
Additional Pump | Required if 2 pump CF system set up is to be used. | ||
Curtain Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialised |
Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
PEEK tube cutter | Any brand | ||
Analytical Scale Balance | Any brand | ||
Stop watch | Any brand | ||
Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels | |
T-piece | Any brand |