L'isolamento di regioni genomiche specifici e l'identificazione di molecole da Associated enChIP

Summary

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Abstract

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

Introduction

È necessaria l'identificazione di molecole associate a specifiche regioni genomiche di interesse per comprendere i meccanismi di regolazione delle funzioni genomiche quali la trascrizione e la regolazione epigenetica. Sebbene siano state sviluppate diverse tecniche per l'analisi biochimica di specifiche regioni genomiche ^1-7, non sono ampiamente utilizzati in questa fase causa dei loro problemi intrinseci quali applicazione limitata (ad esempio, solo per numero alta copy loci o loci con ripetizioni) e troppo tempo e gli sforzi necessari.

Al fine di effettuare analisi biochimica di specifiche regioni genomiche facilmente, abbiamo sviluppato due tecnologie specifiche locus cromatina (chip), vale a dire inserzionale Chip (iChip) ^8-13 e ingegnerizzato DNA-binding ChIP molecola-mediata (enChIP) ^14-17 . In iChip, un luogo di interesse è contrassegnati con l'inserimento di sequenze di riconoscimento di una proteina di legame al DNA esogeno, come LexR. Il locus è quindi isolato da purificazione per affinità con la proteina DNA-binding tag. In enChIP, ingegnerizzati molecole che legano il DNA, come le proteine ​​zinc-finger, (TAL) proteine ​​attivatore-come trascrizione, e cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) complessi, vengono utilizzate per contrassegnare un luogo di interesse (Figura 1). Successivamente, la regione genomica è isolato dalla purificazione per affinità delle molecole DNA-binding targhetta.

Uno dei vantaggi di enChIP sopra iChip è che l'inserimento di sequenze di riconoscimento di una proteina legante il DNA esogeno-non è necessario. Targeting di loci usando complessi CRISPR costituiti da una forma cataliticamente inattiva di Cas9 (dCas9) e una guida RNA (gRNA) è molto più facile che prendere di mira di queste regioni a iChip o enChIP utilizzando TAL e zinco-finger proteine. Qui, descriviamo un protocollo step-by-step per enChIP combinata con spettrometria di massa e RNA sequencing (RNA-Seq) per identificare locus-Associaproteine ​​e RNA ted, rispettivamente.

Protocol

1. Progettazione di Engineered molecole di DNA-binding Riconoscere il Target Locus Per enChIP utilizzando complessi CRISPR, utilizzare lo strumento web CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) per identificare sequenze candidato bersaglio gRNA nella regione genomica di interesse descritto come precedentemente 18. Questo strumento web riporta 23 bp siti genomici della forma 5'-N 20 NGG-3 'all'interno della regione di destinazione. Sintetizzare un gBlock compresa la sequenza del promotore U6 e la sequenza di 5'-N 20 in 5'-N 20 NGG-3 'utilizzando servizi commerciali (vedi Figura 2) 19,20. Ai fini subcloning, includere preposti per enzimi di restrizione al di fuori del gBlock. Inserire il gBlock in un vettore adeguato come descritto in precedenza 16. Diversi vettori retrovirali per gBlocks sono disponibili (vedi Materiali). Per enChIP utilizzando proteine ​​TAL, progettare proteine ​​TAL riconoscendo la target loci. Generare plasmidi che codificano per proteine ​​TAL che utilizzano i servizi commerciali. Genera vettori di espressione contenenti le proteine ​​TAL fusi con una o più variabili come 3 × FLAG come descritto in precedenza 15. 2. Istituzione di cellule per l'analisi enChIP Esprimere 3 × FLAG-dCas9 e il gRNA (procedura basata CRISPR-) oppure 3 × FLAG-TAL (TAL procedura a base di proteine) nelle cellule per essere analizzato come descritto in precedenza 14-17. Utilizzare trasfezione transiente se l'efficienza di trasfezione è alta. Un vettore di espressione contenente 3 × FLAG-dCas9 e il promotore CMV è disponibile (vedi Materiali). Considerare l'istituzione di trasformanti stabili con metodi convenzionali se l'efficienza di trasfezione transiente è bassa. In aggiunta ai suddetti vettori retrovirali per gBlock, vettori retrovirali di 3 × FLAG-dCas9 sono disponibili (vedi Materiali). <li> Conferma l'espressione del 3xFLAG-dCas9 o proteine ​​3xFLAG-TAL nelle cellule trasfettate mediante analisi immunoblot usando un anticorpo anti-FLAG (Ab) come descritto in precedenza 14-17. Nota: L'espressione di queste proteine ​​con tag può anche essere confermata mediante colorazione intracellulare con anticorpi anti-FLAG-FITC e una successiva analisi FACS. Un protocollo per la colorazione intracellulare può essere scaricato dal nostro sito internet (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). Conferma espressione del gRNA dalla tecnica standard RT-PCR. Per l'identificazione quantitativa di proteine ​​che interagiscono con la regione genomica di interesse, prendere in considerazione l'uso di un sistema di etichettatura isotopo stabile da aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) analisi combinata con enChIP (enChIP-SILAC). Nota: supporto per l'analisi SILAC possono essere acquistati da fornitori commerciali. SILAC è potente nel rilevare interazioni specifiche. Cellule di coltura in SILAC medio pesante. Preparare cellule culturosso in mezzo luce SILAC come controllo negativo. Utilizzare almeno 5 × 10 7 cellule per mezzo SILAC (pesante o leggero). Per l'etichettatura efficiente, aggiungere sia L-lisina-2HCl, 13 C 6 e L-Arginina-HCl, 13 C 6, 15 N 4 nei media SILAC pesanti. Nota: Almeno cinque divisioni cellulari sono necessari per le proteine ​​di etichette. Per esempio, la cultura umana cellule fibrosarcoma HT1080 esprimono stabilmente 3xFLAG-dCas9 e un gRNA a 37 ° C e 5% di CO 2 in DMEM media per la SILAC e siero fetale bovino dializzato con lisina-2HCl più L-Arginina-HCl (medio chiaro) o 13 C 6 L-lisina-2HCl più 13 C 6 15 N 4 L-arginina-HCl (medio pesante) (vedi Materiali) 16. Aggiungere 50 mg di leggera o pesante L-lisina-2HCl e L-arginina-HCl in 500 ml di terreno. Cellule trypsinize e replate prima che diventino confluenti modo che le cellule mantengono growt esponenzialeh. 3. La reticolazione di Celle con formaldeide Per le cellule in coltura in sospensione, trasferimento 2 × 10 7 cellule che esprimono proteine ​​3xFLAG-TAL o 3xFLAG-dCas9 più gRNA e sospendere in 30 ml di terreno di coltura normale in una provetta da centrifuga da 50 ml. Quando si utilizzano più celle, aumentare i volumi e le quantità di reagenti proporzionalmente. Per gli esperimenti SILAC, mescolare le cellule coltivate in terreno pesante o leggero medio (5 x 10 7 cellule ciascuno) e dividere il totale di 1 x 10 8 cellule in 5 provette contenenti 2 x 10 7 cellule. Aggiungere 810 ml di formaldeide al 37% a 30 ml di sospensione cellulare (concentrazione finale 1%) e incubare a 37 ° C per 5 min. Per le cellule aderenti, correggere direttamente le cellule in coltura con l'aggiunta di 810 ml di formaldeide al 37% a 30 ml di terreno di coltura. Fermare la reticolazione con l'aggiunta di 3,1 ml di 1,25 M soluzione di glicina (concentrazione finale 127 mm), eincubare a temperatura ambiente per 10 min. Raccogliere le cellule per centrifugazione (300 xg per 5 minuti a 4 ° C). Eliminare attentamente il surnatante compresi formaldeide e conservarla in un flacone di scarico adeguato. Per le cellule aderenti, staccare le cellule con un raschietto cellulare e raccolto in un tubo da 50 ml, e raccogliere le cellule, come descritto in questo passaggio. Per gli esperimenti SILAC, mescolare le cellule staccate coltivati ​​in terreno pesante o media luce (5 x 10 7 cellule ciascuno), dividere il totale di 1 x 10 8 cellule in 5 provette contenenti 2 x 10 7 cellule e raccogliere le cellule come descritto in questo passo. Lavare il pellet con 30 ml di PBS due volte per provetta. Eliminare attentamente il surnatante compresi formaldeide e conservarla in uno spreco appropriata bottle.Handle rifiuti formaldeide secondo le linee guida sulla sicurezza chimica. Le cellule fissate possono essere congelati e conservati a -80 ° C. 4. Preparazione di cromatina (per 2 x 107 cellule) Sospendere le cellule fissate in 10 ml di tampone di lisi cellulare (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630, e 1 × inibitori della proteasi) e incubare in ghiaccio per 10 min. Centrifugare il campione (830 × ga 4 ° C per 8 min) e scartare con attenzione il surnatante. Sospendere il pellet in 10 ml di tampone di lisi nucleare (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% sodio desossicolato, 0,5% lauroylsarcosine, e inibitori della proteasi 1x). Incubare in ghiaccio per 10 minuti e vortice ogni 2-3 minuti. Centrifugare il campione (830 × ga 4 ° C per 8 min) e scartare con attenzione il surnatante. Lavare il pellet in 10 ml di PBS. Il pellet (frazione cromatina) può essere conservato a -80 ° C dopo immediatamente congelati in azoto liquido. 5. Sonicazione di cromatina (a 2 x 10 7 cellule) Sospendere la frazione cromatina in 800 ml dimodificato tampone di lisi 3 (10 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, 0,1% sodio desossicolato, 0,1% SDS, e 1x inibitori delle proteasi) e trasferire in una provetta da 1,5 ml. Sonicare la cromatina utilizzando un sonicatore (vedi Materiali) e le seguenti condizioni: Uscita: 3; dovere: 100% (continuo); e il tempo libero. Eseguire 10-18 cicli di sonicazione per 10 sec e raffreddamento in ghiaccio per 20 sec. Per evitare un eccessivo riscaldamento, incubare i campioni in ghiaccio per 2 minuti ogni 5-6 cicli. Per evitare la formazione di schiuma, mantenere la posizione della punta della sonda sonicazione 0,5 cm sopra il fondo della provetta. Centrifugare il campione a (16.000 xg a 4 ° C per 10 min) e trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 ml. La cromatina sonicato può essere conservato a -80 ° C dopo immediatamente congelati in azoto liquido. 6. Valutazione di cromatina frammentazione Mescolare 10 ml di cromatina frammentata con 85 ml di acqua distillata. Aggiungere 4 ml5 M di NaCl e incubare a 65 ° CO / N. Aggiungere 1 ml di 10 mg / ml RNasi A e incubare a 37 ° C per 45 min. Aggiungere 2 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 ml di 1 M Tris (pH 6,8), e 1 ml di 20 mg / ml proteinasi K, e incubare a 45 ° C per 1,5 ore. Separati 10 microlitri del campione mediante elettroforesi in gel di agarosio all'1% che non contiene coloranti colorazione come SYBR Green. Macchia il gel per valutare la distribuzione delle lunghezze della cromatina frammentata. Le condizioni che generano una lunghezza media di 0,5-2 kbp (range di 0,2-4 kb) sono raccomandati. Purificare il DNA da campioni rimanenti mediante estrazione con fenolo-cloroformio o usando un kit di estrazione del DNA (vedi Materiali). Il DNA purificato può essere utilizzato come DNA di ingresso per stimare le rese di analisi enChIP (vedi 8.11). 7. Preparazione di Dynabeads Coniugato con anticorpi (per 2 x 10 7 cellule) Prepare due provette da 1,5 ml, uno per pre-compensazione utilizzando IgG normale mouse e l'altra per l'incubazione con l'anticorpo anti-FLAG Ab. Aggiungere 150 ml di proteine ​​sfere magnetiche G-coniugato (vedi Materiali) ad ogni provetta. Porre i tubi su un supporto magnete e attendere 3 minuti. Scartare il surnatante pipettando. Sospendere le perline in 1 ml di PBS contenente 0,01% Tween-20 (PBS-T). Porre i tubi su un supporto magnetico e attendere per 2 min. Eliminare il surnatante pipettando, e quindi ripetere il passaggio. Sospendere le perline in 1 ml di PBS-T contenente 0,1% BSA. Aggiungere 15 mg di IgG di topo normale o anti-FLAG Ab e ruotare a 4 ° CO / N. Spin down brevemente, quindi posizionare i tubi su un supporto magnete e attendere 3 minuti. Scartare il surnatante pipettando. Sospendere le perline in 1 ml di PBS-T. Invertire più volte campione e spin down brevemente. Porre i tubi su un supporto magnete e attendere per 3 minuti, poi scartare il surnatante pipettando. Ripetere il lavaggioaltre due volte con PBS-T (totale di tre fasi di lavaggio). 8. Immunoprecipitazione della cromatina (a 2 x 10 7 cellule) Mescolare la cromatina frammentata preparato in 5.3) (circa 800 ml) con un quinto del volume (circa 200 ml) di tampone di lisi 3 modificato contenente 5% Triton X-100 (concentrazione finale di 1% Triton X-100). Aggiungere la soluzione cromatina al tubo in cui proteine ​​G-coniugati biglie magnetiche coniugate con IgG normale del mouse sono stati preparati. Ruotare a 4 ° C per 1 ora. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Trasferire il surnatante nel tubo in cui proteine ​​G-coniugati biglie magnetiche coniugati con anti-FLAG Ab sono stati preparati. Ruotare a 4 ° CO / N. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Scartare il surnatante pipettando. Sospendere le perline in 1 ml di tampone salino basso (20 mM Tris (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inibitori della proteasi, e 1x) e ruotare a 4 ° C per 5 min. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Scartare il surnatante pipettando e ripetere la fase di lavaggio. Lavare le perline con tampone di sali (20 mM Tris (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inibitori della proteasi, e 1x) due volte. Lavare le perline con tampone LiCl (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% sodio desossicolato, e inibitori della proteasi 1x) due volte. Lavare le perline con TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% inibitori IGEPAL CA-630, e 1x proteasi) una volta. Sospendere le perline in 200 ml di tampone di eluizione (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% IGEPAL CA-630, inibitori della proteasi 1x e 500 mcg / ml 3 × FLAG peptide) e incubare a 37 ° C per 20 min. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e ripetere il Elution passo. Purificare DNA da piccola porzione (ad esempio, 5%) dell'eluato mediante estrazione con fenolo-cloroformio o usando un kit di estrazione del DNA (vedi Materiali). Il DNA purificato può essere utilizzato per PCR con primer specifici imposta per stimare le rese di enChIP analisi confrontando con DNA ingresso preparata al punto 6.7 come descritto in precedenza 14,16. 9. SDS-PAGE, colorazione, e analisi spettrometrica di massa Mescolare l'eluato (400 microlitri) con 1 ml di 2-propanolo, 50 ml di 3M acetato di sodio (pH 5,2), e 5 ml di 20 mg / ml di glicogeno. Precipitare la cromatina a -20 ° CO / N. Centrifugare il campione (16.000 xg a 4 ° C per 30 min) e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare di nuovo (16.000 xg a 4 ° C per 10 min). Eliminare il surnatante completamente pipettando. Sospendere il pellet in 40 ml di tampone 2x campione (125 mM Tris (pH 6,8), il 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% di saccarosio, e 0,004% blu di bromofenolo). Vortex per 5 minuti per sciogliere completamente il pellet, e poi incubare a 100 ° C per 30 minuti per denaturare le proteine ​​e invertire la reticolazione. Per SDS-PAGE, eseguire 40 ml di campione sul gel finché il colorante raggiunge 1 cm sotto il pozzo. Nota: Usiamo solitamente 4-20 gel% di pendenza, ma altri gel% può essere utilizzato. Colorare il gel con Coomassie Brilliant Blue o macchia d'argento. Tagliare il gel in cinque pezzi (2 mm) di altezza. Eseguire la digestione gel e spettrometria di massa come descritto in precedenza 13-16. Per gli esperimenti SILAC con 5 x 10 7 cellule ciascuna (totale di 1 x 10 8 cellule), sospendere pellet dagli iniziali cinque tubi in 40 ml di tampone 2x campione (non è necessario scalare). 10. Purificazione di RNA e l'RNA-Seq Analisi Per purificare l'RNA dopo enChIP, aggiungere 5 U / ml di RNase Inhibitor (seMateriali e) a tutte le soluzioni tampone, tranne modificato lysis buffer 3 e il tampone di eluizione, a cui aggiungere 40 U / ml di RNasi Inhibitor. Mescolare l'eluato (400 ml) con 16 ml di NaCl 5 M e incubare a 65 ° C per 2 ore. Aggiungere 1 ml di reagente acido-guanidinio-base-fenolo (vedi Materiali) al campione. Vortex per 15 secondi e poi incubare a temperatura ambiente per 5-15 min. Centrifugare il campione per 15 minuti a 12.000 xg e RT. Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1,5 ml e aggiungere 5 ml di p-bromoanisole. Vortex per 15 secondi e poi incubare a temperatura ambiente per 3-5 minuti. Centrifugare il campione per 10 minuti a 12.000 xg e RT. Trasferire il surnatante (circa 1 ml) in un nuovo tubo 2 ml e aggiungere 1 ml di 2-propanolo. Capovolgere la provetta e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Caricare il composto su una colonna in un kit di purificazione dell'RNA (vedi Materiali). Centrifugare colonna per 1 min a 12.000 × g e RT. lavaggiola colonna con 400 ml di RNA tampone di lavaggio in un kit di purificazione di RNA (vedi Materiali). Aggiungere 80 ml di DNasi I cocktail (miscela di 5 ml di DNasi I (1 U / ml), 8 ml di 10 × DNasi I tampone di reazione, 3 ml di acqua priva di RNasi DNase /, e 64 ml di RNA tampone di lavaggio in un kit di purificazione dell'RNA (vedi Materiali)) per la colonna. Incubare il campione a 37 ° C per 15 minuti, quindi si centrifuga per 30 sec a 12.000 xg e RT. Lavare la colonna con 400 ml di RNA prelavaggio tampone in un kit di purificazione di RNA (vedi Materiali) due volte. Eluire l'RNA con 50 ml di acqua / RNasi-free DNasi. L'RNA eluito può essere utilizzato per il sequenziamento RNA.

Representative Results

Complessivamente, 1-30% del bersaglio regioni genomiche può essere purificato usando enChIP. Figura 3 include dati rappresentativi che mostrano le rese di enChIP le analisi di targeting telomeri e il promotore del interferone (IFN) regolamentazione factor-1 (IRF-1) gene. Come esempi di risultati tipici, tabella 1 elenca le proteine ​​associate al IRF-1 promotore in maniera IFNγ specifica identificata dai enChIP-SILAC, Tabella 2 elenca le proteine-telomeri legame individuati dalla enChIP combinata con la spettrometria di massa (enChIP-MS) , e Tabella 3 elenca le RNA associati a telomeri identificate da enChIP-RNA-Seq. Figura 1. Panoramica enChIP. enChIP utilizzando CRISPR (A, B) e TAL (C, D, E </forte è mostrato>). Un luogo di interesse è etichettato con le molecole di DNA-binding ingegnerizzati, come una proteina TAL o il sistema CRISPR costituito da una forma cataliticamente inattiva di Cas9 (DCA) e RNA guida (gRNA). Le interazioni molecolari sono fissati con formaldeide o altri reticolanti, se necessario. Successivamente, la cromatina fisso è frammentata mediante ultrasuoni o digestione enzimatica. Le regioni genomiche taggati vengono purificati dalla purificazione di affinità. Infine, reticolazione è invertita, e le molecole che interagiscono (regioni genomiche, RNA e proteine) sono identificati mediante sequenziamento di nuova generazione e la spettrometria di massa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Sequenza di gBlock. Il promotore U6 (in nero), il G nucleotide brima la sequenza di guida (in blu), viene mostrata la sequenza di guida (gRNA distanziatore) (in rosso), la sequenza di ponteggio (in verde), e la sequenza di terminazione (in arancione). Figura 3. I rendimenti di analisi enChIP rappresentante. Ingressi (A) percentuale per l'obiettivo di IRF-1 locus e la non bersaglio Sox2 locus. Ingressi (B) percentuali per i telomeri bersaglio e non bersaglio gamma-satelliti. Le cifre sono state adattate e modificato da precedenti pubblicazioni 15,16. Categorie Proteine Trascrizione DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo omologo, PURβ, attivato RNA polimerasi II trascrizionale attivatore p15, BTF3, Myb vincolanteproteina 1A Histone deacetilazione, componenti corepressor RBBP4, PA2G4, TBL3 Acetiltrasferasi Proteine ​​arginina N-metiltransferasi 1 DNA topoisomerasi DNA topoisomerasi 2α Istoni Histone H2A.Z, istone H3.2 Tabella 1:. Esempi di proteine ​​associate con la IRF-1 promotore umano in modo IFNγ specifica identificata dai enChIP-SILAC La tavola è stato ricavato da una pubblicazione precedente 16. Categorie Proteine Proteine ​​telomeri legame mammiferi PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 Telomere-biproteine ​​nding nel lievito o altri organismi IMP4 Le proteine ​​che interagiscono con telomeri vincolante proteine ​​[proteina telomeri legame associato] DNA polimerasi α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1], exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1], exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] Le proteine ​​localizzando a heterochromatin BEND3 Le proteine ​​che regolano segnali epigenetici KDM5C Le proteine ​​le cui mutazioni influenzare la funzione dei telomeri Α DNA polimerasi (POLA1), hat1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutammato-cisteina ligasi, glutaredossina, SMRC1 Tabella 2:. Esempi di proteine ​​associate con telomeri del mouse identificate da enChIP-MS La tabella è stata adapted da una pubblicazione precedente 15. Categorie RNA Componenti della telomerasi TERC, RMRP Telomeric RNA Terras scaRNAs Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 H / ACA snoRNAs Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a C / D snoRNAs Snord17, Snord15a, Snord118 lncRNA Neat1 Tabella 3: Esempi di RNA associati a telomeri del mouse identificate da enChIP-RNA-Seq La tavola è stato ricavato da una pubblicazione precedente 17..

Discussion

Here, we describe the purification of specific genomic regions using engineered DNA-binding molecules such as the CRISPR system and TAL proteins, and the identification of proteins and RNAs bound to these genomic regions. Binding of engineered DNA-binding molecules to the genome may affect chromatin structure, including nucleosome positioning, and may abrogate genomic functions, as described in CRISPR interference experiments²¹. To avoid these potential aberrant effects, we propose specific guidelines for choosing target genomic regions. First, to avoid potential inhibition of the recruitment of RNA polymerases and transcription factors, as well as disruption of nucleosome positioning around the transcription start site, the target regions for analyses of promoter regions should be several hundred base pairs upstream of (5′ to) the transcription start site. By contrast, when analyzing genomic regions with distinct boundaries, such as enhancers and silencers, genomic regions that are directly juxtaposed to these regions can be targeted because it is less likely that the binding of engineered DNA-binding molecules will affect their functions. Furthermore, it is best to avoid using target regions that are conserved among different species, because important DNA-binding molecules often bind to evolutionarily conserved regions and inhibition of their binding might disrupt the functions of the target genomic regions. In this regard, it is always necessary to check that the function of the target genomic region is maintained in the established cells used for enChIP analyses. Because multiple gRNAs can be tested easily and it is tedious and expensive to generate multiple versions of TAL or zinc-finger proteins recognizing different target genomic regions, enChIP using CRISPR is more advantageous than enChIP using other proteins.

It has been shown that dCas9 binds to off-target sites although affinity to those sites might be weaker than that to the target sites^22-25. There are several ways to manage contamination of molecules bound to those off-target sites. First, the use of several, at least two, different gRNAs would be recommended. Those molecules commonly observed in enChIP using distinct gRNAs would be true positives. Second, comparison of different conditions for enChIP would be effective in cancelling contamination of non-specific molecules and molecules bound to off-target sites. Examples of those comparison sets would be (i) stimulation (-) and (+), or (ii) different cell types such as T cells vs. B cells. Finally, quantitative analysis of binding of candidate molecules should be performed to confirm their specific binding to the target sites. It is preferable to prepare cells expressing only dCas9 but not gRNA as a negative control.

Using enChIP analyses, we were able to successfully identify a number of known and novel molecules interacting with specific genomic regions (Tables 1-3)^14-17. However, this technique failed to detect some other known proteins interacting with these regions. For example, STAT1 reportedly associates with the IRF-1 promoter upon IFNγ stimulation⁸, but our enChIP-SILAC analysis did not detect STAT1 as a protein induced to interact with this genomic region¹⁶. In addition, in the enChIP-MS analysis of telomeres, we did not detect shelterin proteins consisting of TRF-1 and TRF-2¹⁵, which have been shown to interact with telomeres²⁶. There are a few potential reasons for these discrepancies. First, the stoichiometry of binding of Stat1 to the IRF-1 promoter might be very low. It is reasonable that enChIP-MS, including enChIP-SILAC, detects proteins that are more abundantly associated with target genomic regions; hence, the analysis of more cells might be necessary to detect these proteins. Increases in the sensitivities of MS instruments would also contribute to the efficient detection of proteins with low stoichiometric binding. Second, some proteins, possibly including Stat1 and shelterins, might be difficult targets for MS analyses. Third, in our analysis of telomere-binding proteins¹⁵, the 3×FLAG-TAL proteins recognizing telomeres (3×FN-Tel-TAL) might have blocked the binding of shelterins to telomeres in a competitive fashion.

In contrast to the relative difficulty of detecting transcription factors binding to specific genomic regions using enChIP, we successfully identified epigenetic regulators such as histone modification enzymes using enChIP analyses. The success of this technique may be due to the fact that epigenetic regulators bind to a broad range of genomic regions; hence, more proteins per genomic region are available for MS. Because epigenetic regulators are increasingly recognized as important targets for drugs against intractable diseases such as cancer, enChIP would be a useful tool for the identification of epigenetic drug targets.

Materials

gBlock synthesis service	Life Technologies	Gene Synthesis by GeneArt
gBlock synthesis service	IDT (Integrated DNA Technologies)	gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
TAL synthesis service	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
DMEM medium for SILAC	Life Technologies	89985	Other medium can be purchased from Life Technologies
Dialyzed FBS for SILAC	Life Technologies	89986
L-Lysine-2HCl for SILAC	Life Technologies	89987	for Light medium
L-Arginine-HCl for SILAC	Life Technologies	89989	for Light medium
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Life Technologies	89988	For Heavy medium
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Life Technologies	89990	For Heavy medium
Complete, mini, EDTA-free	Roche Diagnostics	4693159
Ultrasonic Disruptor UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
HTC-PAL autosampler	CTC Analytics		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis