Isolatie en<em> Ex Vivo</em> Cultuur van Vδ1⁺ CD4⁺ γδ T-cellen, een Extrathymic αβT-cel Progenitor

Summary

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Abstract

De thymus, de voornaamste orgaan voor het genereren van αβ T-cellen en ruggengraat van het adaptieve immuunsysteem bij vertebraten, is lang beschouwd als de enige bron van αβT cellen. Toch thymus involutie begint vroeg in het leven leidt tot een drastisch verminderd vermogen van naïeve αβT cellen in de periferie. Toch kunnen zelfs honderdjarigen bouwen immuniteit tegen nieuw verworven pathogenen. Recent onderzoek suggereert extrathymic αβT cel ontwikkeling, maar ons begrip van de trajecten die kunnen compenseren voor thymus verlies van functie nog rudimentair. γδ T-cellen aangeboren lymfocyten die de belangrijkste T-cel-subgroep in het weefsel vormen. We hebben onlangs een tot nu toe niet gewaardeerd uitstekende functie om een γδ T-cel subgroep toegeschreven door te laten zien dat de schaarse entiteit van CD4 ⁺ Vδ1 γδ ⁺ T-cellen kunnen transdifferentiëren in αβT cellen in inflammatoire aandoeningen. Hier hebben we provide het protocol voor de isolatie van deze voorlopercellen uit perifeer bloed en de daaropvolgende teelt. Vδ1 cellen positief verrijkt uit PBMC van gezonde humane donoren via magnetische partikels, gevolgd door een tweede stap waarbij we richten de schaarse fractie van CD4 ⁺ cellen met een verdere magnetische labeling techniek. De magnetische kracht van het tweede etiket dan die van de eerste magnetische label, waardoor aldus het efficiënt kwantitatieve en specifieke positieve isolatie van de populatie van belang. Vervolgens voeren de techniek en kweekomstandigheid vereist voor klonering en efficiënt uitbreiden van de cellen en voor de identificatie van klonen gegenereerd door FACS-analyse. Zo bieden we een gedetailleerd protocol voor de zuivering, cultuur en ex vivo expansie van CD4 ⁺ Vδ1 γδ ⁺ T-cellen. Deze kennis is voorwaarde voor studies die betrekking hebben op deze αβT cel progenitor`s biologie en voor degenen die willen identify de moleculaire triggers die betrokken zijn bij de transdifferentiatie.

Introduction

In vertebraten, adaptieve immuniteit die is gestructureerd in de cellulaire en humorale deel van immuniteit speelt een belangrijke rol bij de afweer tegen ziekteverwekkers. De herkenning van een groot aantal antigenen wordt gemedieerd door hyperpolymorphic T- en B-celreceptoren (TCR / BCR), die met betrekking tot T-cellen worden aangenomen dat voornamelijk geproduceerd in de thymus ^1. Daartoe hematopoietische stamcellen (HSCs), verkregen uit beenmerg, de thymus zaad en differentiëren langs goed gedefinieerde stadia uiteindelijk aanleiding geven tot alle T-cellijnen. Thymus zaaien voorlopers zijn CD4 ^– en CD8 ^– en daarmee de onvolwassen, dubbele ontkenning (DN) thymocyte fractie vormen. Thymus afgeleide signalen vervolgens hun lineage inzet en de differentiatie in ofwel αβ of γδ T-cellen induceren. De expressie van functioneel herschikte TCR-γ en δ TCR-keten genen in DN2 / 3 thymocyten leidt tot δTCR complexen, die cellulaire proliferatie een aandrijving yd bevorderen differentiatie in γ AT cellen ^2,3. In tegenstelling, de omlegging van een functionele TCR-β-keten, die koppelen met preTα een preTCR pT bouwen, induceert de transcriptionele silencing van het TCR-γ keten DN3 thymocyten en hun overgang in CD4 ⁺ CD8 ⁺ dubbel positieve thymocyten ⁴ . In dit stadium recombinatie van de TCR-α-keten optreedt, verwijderen van de TCR-δ locus dat ligt binnen de TCR-α locus, waardoor intrekking van de productie een γδTCR in deze cellen onherroepelijk ^5-9. Herschikt αβTCRs worden vervolgens geselecteerd op hun vermogen om zelf-MHC zwak binden (positieve selectie), die niet een bepaalde drempel overschrijden om auto-immuniteit (negatieve selectie) te vermijden. Volgens hun bindingscapaciteit MHC klasse I of II, het geselecteerde αβT cellen ontwikkelen tot enkele positieve CD4 ⁺ of CD8 ⁺ T-cellen, die uitgang de thymus als naïeve T-cellen.

Echter, involutie van de thymus begint vroeg in het leven leidt tot exponentieel verminderd vermogen van naïeve T-cellen die bijna gedoofd na de adolescentie ^10. Niettemin, de grootte van de T-cel pool blijft constant gedurende het gehele leven, dat slechts gedeeltelijk kan worden verklaard door post-thymus homeostatische proliferatie van T-cellen en de proliferatie van langlevende immunologisch geheugen ^11. Bijgevolg moet extrathymic T cel ontwikkeling plaatsvinden. Recent onderzoek heeft aanzienlijke aantrekkingskracht die αβT cel voorlopercellen, die een-op extrathymic locaties-gaven aanleiding tot functionele αβ T-cellen ^12-17 gekenmerkt opgedaan. Toch, gedetailleerde kennis over extrathymic αβT cel voorlopers die onafhankelijk zijn van een thymus differentiëren in αβT cellen is zo fragmentarisch als de achtergrond dat we op de route die ze daarbij maken.

We hebben onlangs de kleine T-cel entiteit van Vδ1 ⁺ geïdentificeerd </sup> CD4 ⁺ cellen γδT als extrathymic αβT cel prognitor ^18, die, wanneer geïsoleerd uit perifeer bloed van gezonde donoren kunnen transdifferentiëren in αβT cellen in een milde inflammatoire omgeving. Interessant en in tegenstelling tot de homeostatische proliferatie van post-thymus T-cellen, transdifferentiatie van Vδ1 CD4 ⁺ cellen genereert nieuwe T-cel receptoren, waardoor het verbreden van de diversiteit repertoire, zodat die potentieel nieuwe antigenen kunnen worden herkend en kan de bescherming van de gastheer tegen nieuw verworven pathogenen. Dit draagt ​​bij aan de plasticiteit van T-cellen en voegt nu toe unappreciated nieuwe route voor extrathymic T cel ontwikkeling.

De kwantitatieve isolatie van lymfocyten, opwekking van eencellige klonen en doeltreffend expansie essentieel voor de doelstelling om die merkers en moleculen die leiden deze αβT cel precursor`s extrathymic ontwikkeling te identificeren.

Protocol

Ethic Verklaring: Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en werden goedgekeurd door de Clinical ethische commissie van de universiteit van Tübingen (projecten 38 / 2009B02 en 470 / 2013B02). 1. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMCs) Neem 50-100 ml van een gezonde vrijwilliger via venapunctie met behulp van een 50 ml spuit met 1000 IE heparine sulfaat en verdunnen het bloed 1: 2 met PBS (pH = 7,2). Laag voorzi…

Representative Results

Figuur 1 toont de verschillende stappen en het resultaat van de isolatie van Vδ1 T-cellen uit perifeer bloed. Figuur 1A toont een typische verdeling van Vδ1 + cellen CD3 + lymfocyten, evenals de co-receptor expressie van de Vδ1 + populatie. In deze donor, de frequentie van Vδ1 + cellen (rood) is 2,3% van de totale lymfocyten en CD4-expressie (groen) van Vδ1 + lymfocyten is 2,6%. Al met al, de doelgroep voor isolatie vertegenwoo…

Discussion

Om het fenotype, biologie en functie van een schaarse (T-) cel entiteit bestuderen, namelijk Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ T-cellen, gebruikten we twee markers: Vδ1 en CD4 om de positieve magnetische celisolatie. Vδ1 een orphan receptor, terwijl CD4 tot expressie op T helpercellen, op een lager niveau op monocyten en dendritische cellen, en op een zeer laag niveau hematopoïetische progenitorcellen.

Technieken voor de verrijking en selectie van cellen in hoge zuiverheid onder fluoresc…

Materials

Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D