Isolering og<em> Ex vivo</em> Kultur Vδ1⁺ CD4⁺ γδ T-celler, en Extrathymic αβT-celleprogenitor

Summary

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Abstract

Brissel, primære organ til generering af ap T-celler og rygraden i det adaptive immunsystem hos hvirveldyr, har længe været betragtet som den eneste kilde til αβT celler. Alligevel thymusinvolution begynder tidligt i livet fører til en drastisk reduceret produktion af naive αβT celler i periferien. Ikke desto mindre kan endda centenarians opbygge immunitet mod nyerhvervede patogener. Nyere forskning tyder extrathymic udvikling αβT celle, men vores forståelse af veje, der kan kompensere for thymisk tab af funktion er stadig rudimental. γδ T-celler er medfødte lymfocytter, som udgør den vigtigste T-celle delmængde i vævene. Vi har for nylig tilskrives en hidtil unappreciated enestående funktion til en γδ T-celle delmængde ved at vise, at den knappe enhed af CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ T-celler kan transdifferentiate ind αβT celler i inflammatoriske tilstande. Her har vi srovide protokollen til isolering af denne stamfader fra perifert blod og efterfølgende dyrkning. Vδ1 celler er positivt beriget fra PBMCer fra sunde humane donorer under anvendelse af magnetiske perler, efterfulgt af et andet trin, hvor vi målrette knappe fraktion af CD4 ^{+ -celler} med et yderligere magnetisk mærkning teknik. Den magnetiske kraft af den anden mærkning overstiger en af ​​de første magnetiske etiket og tillader således effektiv, kvantitative og specifik positiv isolation af populationen af ​​interesse. Vi derefter indføre teknikken og dyrkningsbetingelser nødvendige for kloning og effektivt udvide cellerne og til identifikation af de genererede kloner ved FACS-analyse. Således giver vi en detaljeret protokol til rensning, kultur og ex vivo ekspansion af CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ T-celler. Denne viden er forudsætningen for undersøgelser, der relaterer sig til denne αβT celle progenitor`s biologi og for dem, der har til formål at IDEntify de molekylære udløsere, der er involveret i sin transdifferentiering.

Introduction

I hvirveldyr, adaptiv immunitet, som er struktureret i cellulær og en humoral del af immunitet spiller en vigtig rolle i forsvaret mod patogener. Anerkendelse af en lang række antigener medieres af hyperpolymorphic T- og B-celle receptorer (TCR / BCR), som med hensyn til T-celler antages primært at blive produceret i thymus ^1. Dertil, hæmatopoietiske stamceller (HSC'er), der stammer fra knoglemarv, frø thymus og differentiere langs veldefinerede faser endelig giver anledning til alle T-celle slægter. Thymus seeding progenitorer er CD4 ^– og CD8 ^{– og dermed} udgøre umodne, dobbelt negative (DN) thymocyt fraktion. Thymus-afledte signaler derefter fremkalde deres slægt engagement og differentiering til enten ap eller γδ T-celler. Ekspressionen af ​​funktionelt omlejrede TCR-y og TCR-A kædegener i DN2 / 3 thymocytter fører til y δTCR komplekser, der øger cellulær proliferation end fremme differentiering til γ AT celler ^2,3. I modsætning hertil omlejring af et funktionelt TCR-β-kæde, der kan parre med preTα at opbygge en preTCR pT, inducerer den transkriptionelle inaktivering af TCR-γ-kæde i DN3 thymocytter og deres overgang til CD4 ⁺ CD8 ⁺ dobbelt-positive thymocyter ⁴ . På dette stadium rekombination af TCR-α-kæden forekommer, sletning af TCR-δ locus som putter i TCR-α locus, således ophæver produktionen en γδTCR i disse celler uigenkaldeligt ^5-9. Omarrangerede αβTCRs efterfølgende udvalgt for deres evne til at binde selv-MHC svagt (positiv selektion), som ikke må overstige en vis tærskel for at undgå autoimmunitet (negativ selektion). Ifølge deres evne til at binde MHC klasse I eller II, af det valgte αβT celler i single-positive CD4 ⁺ eller CD8 ^{+ -T-celler,} som exit thymus så naive T-celler.

Imidlertid involution af thymus starter tidligt i livet fører til eksponentielt faldende produktion af naive T-celler, der er næsten slukket efter puberteten ^10. Ikke desto mindre, størrelsen af T-celle pool forbliver konstant gennem hele livet, hvilket kan forklares kun delvis med post-thymus homeostatiske proliferation af T-celler og spredning af langlivede immunologisk hukommelse ^11. Følgelig må extrathymic T-celleudvikling forekomme. Nyere forskning har fået betydelig attraktion, der prægede αβT-stamceller, som-at extrathymic steder-gav anledning til funktionel ap T-celler ^12-17. Alligevel detaljeret viden om extrathymic αβT celleforstadier at uafhængig fra en thymus differentiere ind αβT celler er så fragmentarisk som baggrund, at vi har på ruten de tager derved.

Vi har for nylig identificeret den lille T-celle enhed i Vδ1 ⁺ </sup> CD4 ⁺ γδT celler som en extrathymic αβT celle prognitor ^{18, som} når det isoleres fra perifert blod fra raske humane donorer kan transdifferentiate ind αβT celler i en mild inflammatorisk miljø. Interessant og i modsætning til den homeostatiske spredning af post-thymiske T-celler, transdifferentiering af Vδ1 ^CD4 + celler genererer nye T-celle-receptorer, og dermed udvide repertoiret mangfoldighed, således at potentielt nye antigener kan anerkendes og kan beskyttelse værten mod nyerhvervede patogener. Det bidrager til plasticitet af T-celler og tilføjer et hidtil unappreciated ny vej for extrathymic T-celle udvikling.

Den kvantitative isolation fra lymfocytiske kilder, generering af single-celle-kloner og deres effektive ekspansion er afgørende for målsætningen om at identificere de markører og molekyler, der udløser denne αβT celle precursor`s extrathymic udvikling.

Protocol

Etik Statement: Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og blev godkendt af den kliniske etiske komité ved universitetet i Tübingen (projekter 38 / 2009B02 og 470 / 2013B02). 1. Isolering af perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) Tag 50-100 ml fra en rask frivillig via venepunktur under anvendelse af en 50 ml sprøjte indeholdende 1.000 IE heparin sulfat og blodet fortyndes 1: 2 med PBS (pH = 7,2). Forsigtigt lag 35 ml blod: …

Representative Results

Figur 1 viser de forskellige trin og resultatet af isoleringen af Vδ1 T-celler fra perifert blod. Figur 1A viser en typisk fordeling af Vδ1 + -celler i CD3 + lymfocytter, samt co-receptor ekspression af Vδ1 + populationen. I denne donor frekvensen af Vδ1 + celler (rød) er 2,3% af de samlede lymfocytter og CD4-ekspression (grøn) i Vδ1 + lymfocytter er 2,6%. Tilsammen repræsenterer målgruppen til isolering 0,06% af de samlede…

Discussion

For at undersøge fænotypen, biologi og funktion af en knap (T) celle enhed, nemlig Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ T-celler anvendte vi to markører: Vδ1 og CD4 for dets positive magnetiske celleisolering. Vδ1 er en orphan-receptor, mens CD4 udtrykkes på T-hjælperceller, på et lavere niveau på monocytter og dendritiske celler, og på et meget lavt niveau på hæmatopoietiske progenitorceller.

Teknikker til berigelse og selektion af celler med høj renhed omfatter fluorescensaktive…

Materials

Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D