Isolation und<em> Ex Vivo</em> Kultur des Vδ1⁺ CD4⁺ γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

Summary

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Abstract

Thymus, das wichtigste Organ für die Erzeugung von αβ-T-Zellen und das Rückgrat des adaptiven Immunsystems bei Wirbeltieren, ist seit langem als die einzige Quelle von αβT Zellen berücksichtigt. Dennoch beginnt Thymusinvolution im Leben, die zu einer drastisch reduzierten Leistung von naiven αβT Zellen in die Peripherie zu früh. Dennoch können sogar Hundertjährigen Immunität gegen neu erworbenen Erreger aufzubauen. Jüngste Untersuchungen legen nahe extrathymic αβT Zellentwicklung, aber unser Verständnis der Signalwege, die für Thymus-Funktionsverlust kompensieren kann immer noch rudimentär. γδ T-Zellen sind angeboren Lymphozyten, die den Haupt T-Zell-Untergruppe in den Geweben dar. Wir haben vor kurzem eine bisher unbeachtet herausragende Funktion zu einem γδ T-Zell-Untergruppe zugeschrieben durch die zeigen, dass die knappe Einheit ^von CD4 + Vδ1 ⁺ γδ T-Zellen können in αβT Zellen in entzündlichen Erkrankungen transdifferen. Hier haben wir provide das Protokoll für die Isolierung dieser Progenitorzellen aus dem peripheren Blut und die anschließende Kultivierung. Vδ1 Zellen positiv von PBMCs von gesunden menschlichen Spendern unter Verwendung von magnetischen Kügelchen angereichert, gefolgt von einem zweiten Schritt, bei dem man gezielt die knappen Fraktion von CD4 ⁺ Zellen mit einem weiteren magnetischen Markierungstechnik. Die Magnetkraft der zweiten Kennzeichnung der als einer der ersten magnetischen Etiketten überschreitet, und ermöglicht die effiziente, quantitative und spezifische positive Isolation der Population von Interesse so. Danach führen die Technik und die Kulturbedingungen für die Klonierung und effizient Expansion der Zellen und zur Identifizierung der erzeugten Klone mittels FACS-Analyse erforderlich. Somit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Reinigung, die Kultur und ex vivo Expansion von CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ T-Zellen. Dieses Wissen ist Voraussetzung für Studien, die zu dieser αβT Zell progenitor`s Biologie beziehen, und für diejenigen, die ide Zielntify die molekularen Auslöser, die in ihrer Transdifferenzierung beteiligt sind.

Introduction

Bei Wirbeltieren spielt adaptiven Immunität, die in der zellulären und humoralen Immunität Teil strukturiert ist, eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern. Die Erkennung von einer Vielzahl von Antigenen durch hyperpolymorphic T- und B-Zell-Rezeptoren (TCR / BCR), der in Bezug auf T-Zellen wird angenommen, dass vor allem im Thymus ¹ produziert werden, vermittelt. Daran, hämatopoetische Stammzellen (HSC), aus dem Knochenmark, Samen der Thymus und Differenzierung entlang gut definierte Stadien schließlich, die zu allen T-Zell-Linien. Thymus Impfen Vorläuferzellen sind CD4 ^– und CD8 ^{– und damit} stellen die unreifen, doppelt negative (DN) Thymozyten Fraktion. Thymus-abgeleiteten Signale dann zu induzieren ihre Abstammung Engagement und die Differenzierung entweder in αβ bzw. γδ T-Zellen. Die Expression von funktionell neu arrangierte TCR-γ und δ TCR-Kettengene in DN2 / 3 Thymozyten zu δTCR Komplexe, die Zellproliferation eine Fahrt ggr;d Förderung der Differenzierung in γ & dgr; T-Zellen ^2,3. Im Gegensatz dazu ist die Umlagerung einer funktionellen TCR-β-Kette, die mit preTα koppeln kann, um eine preTCR pT aufzubauen, induziert die transkriptionalen Silencing des TCR-γ-Kette in DN3 Thymozyten und deren Übergang in CD4 ⁺ CD8 ⁺ doppelt positiven Thymozyten ⁴ . In diesem Stadium Rekombination des TCR-α-Kette auftritt, das Löschen der TCR-δ-Locus, die im TCR-α-Locus eingebettet, wodurch eine Aufhebung der Produktions γδTCR in diesen Zellen unwiderruflich ^5-9. Umgeordnet αβTCRs werden anschließend auf ihre Fähigkeit zur Selbst MHC schwach binden (positive Selektion), die einen bestimmten Schwellenwert nicht übersteigen darf, um Autoimmunerkrankungen (negative Selektion) vermeiden ausgewählt. Entsprechend ihren Möglichkeiten zu binden MHC-Klasse I oder II, entwickeln die ausgewählten αβT Zellen in Einzel positive ^CD4 + oder ^CD8 + T-Zellen, die Ausfahrt der Thymus als naive T-Zellen.

, Rückbildung des Thymus beginnt jedoch schon früh im Leben, die zu exponentiell verringert Leistung von naiven T-Zellen, die fast erloschene Postadoleszenz ¹⁰ ist. Dennoch bleibt die Größe der T-Zell-Pools während des gesamten Lebens, die nur teilweise durch post-Thymus homöostatische Proliferation von T-Zellen und der Proliferation der langlebig immunologischen Gedächtnisses ¹¹ erklärt werden kann, konstant. Folglich muss extrathymic T-Zell-Entwicklung auftritt. Die neuere Forschung hat erhebliche Anziehungskraft, die αβT Vorläuferzellen, die bei extrathymic-sites-verursachte Funktions αβ T-Zellen ^12-17 gekennzeichnet gewonnen. Dennoch ist detailliertes Wissen über extrathymic αβT Vorläuferzellen, die aus einem Thymus-unabhängige differenzieren sich in αβT Zellen als fragmentarisch wie der Hintergrund, dass wir auf dem Weg, den sie so zu nehmen.

Vor kurzem haben wir das kleine T-Zellen-Einheit der Vδ1 ⁺ identifiziert </sup> ^CD4 + Zellen γδT als extrathymic αβT Zell prognitor ^18, die, wenn sie aus dem peripheren Blut von gesunden menschlichen Spendern isoliert in einem milden entzündlichen Umgebung in αβT Zellen transdifferen. Interessanter und entgegen der homöostatischen Proliferation von post-Thymus-T-Zellen, Transdifferenzierung Vδ1 CD4 ⁺ Zellen generiert neue T-Zell-Rezeptoren, wodurch die Erweiterung des Repertoires Diversität, so dass potentiell neuer Antigene erkannt werden, und kann den Schutz des Wirtes gegen neu erworbenen Erregern. Dies trägt zur Plastizität von T-Zellen und fügt eine bisher unbeachtet neuen Weg für extrathymic T-Zell-Entwicklung.

Die quantitative Isolierung von lymphatischer Quellen, die Erzeugung von Einzelzellklonen und deren effiziente Expansion sind wesentlich für das Ziel, jene Marker und Moleküle, die diese auslösen αβT Zell precursor`s extrathymic Entwicklung zu identifizieren.

Protocol

Ethik Statement: Alle Verfahren wurden nach der Deklaration von Helsinki durchgeführt und wurden von der Klinischen Ethikkommission der Universität Tübingen genehmigt (Projekte 38 / 2009B02 und 470 / 2013B02). 1. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) Nehmen Sie 50-100 ml von einem gesunden Freiwilligen über Venenpunktion unter Verwendung einer 50 ml Spritze mit 1.000 IE Heparinsulfat und verdünnt das Blut 1: 2 mit PBS (pH = 7,2). Sorgfältig Sc…

Representative Results

Figur 1 zeigt die verschiedenen Schritte und das Ergebnis der Trennung der Vδ1 T-Zellen aus dem peripheren Blut. 1A zeigt eine typische Verteilung der Vδ1 + Zellen CD3 + Lymphozyten, sowie die Co-Rezeptor die Expression des Vδ1 + -Population. In diesem Spender, ist die Frequenz der Vδ1 + Zellen (rot) 2,3% des Gesamtlymphozytenzahl und der CD4-Expression (grün) der Vδ1 + Lymphozyten beträgt 2,6%. Insgesamt ist die Zielgruppe f…

Discussion

Um den Phänotyp, der Biologie und Funktion einer knappen (T-) Zell Einheit zu studieren, nämlich Vδ1 ^{+ CD4} + T-Zellen, verwendeten wir zwei Marker: Vδ1 und CD4 für seine positive magnetische Zellisolierung. Vδ1 ist ein Orphan-Rezeptor, während CD4 auf T-Helfer-Zellen exprimiert wird, auf einem niedrigeren Niveau auf Monozyten und dendritischen Zellen, und auf einem sehr niedrigen Niveau von hämatopoetischen Vorläuferzellen.

Techniken zur Anreicherung und Selektion von Zel…

Materials

Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D