Isolamento e<em> Ex Vivo</em> Cultura di Vδ1<sup> +</sup> CD4<sup> +</sup> Celle γδ T, un Extrathymic αβT-cellule progenitrici
Summary
Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.
Abstract
Il timo, l'organo principale per la generazione di cellule T αβ e spina dorsale del sistema immunitario adattativo in vertebrati, è stata a lungo considerata come unica fonte di cellule αβT. Eppure, involuzione timica inizia presto nella vita che porta ad un'uscita drasticamente ridotto di cellule αβT naïve in periferia. Tuttavia, anche centenari possono costruire immunità contro gli agenti patogeni di nuova acquisizione. Recenti ricerche suggeriscono lo sviluppo delle cellule αβT extrathymic, tuttavia la nostra comprensione dei percorsi che possono compensare la perdita della funzione timica sono ancora rudimentali. γδ cellule T sono linfociti innate che costituiscono il principale sottoinsieme cellule T nei tessuti. Recentemente abbiamo attribuito un finora incompreso importante funzione di un sottoinsieme delle cellule T γδ mostrando che la scarsa entità dei CD4 + Vδ1 + γδ cellule T possono transdifferenziarsi in cellule αβT in condizioni infiammatorie. Qui, si provide il protocollo per l'isolamento di questo progenitrici da sangue periferico e la sua successiva coltivazione. Cellule Vδ1 sono positivamente arricchiti da PBMC di donatori umani sani utilizzando sfere magnetiche, seguita da una seconda fase in cui puntiamo la scarsa frazione di cellule CD4 + con un ulteriore tecnica di etichettatura magnetica. La forza magnetica del secondo nell'etichettatura supera quello della prima etichetta magnetica, e quindi permette efficiente, quantitative e specifiche isolamento positivo della popolazione di interesse. Abbiamo poi introdurre la condizione tecnica e la cultura necessaria per la clonazione e in modo efficiente l'espansione delle cellule e per l'identificazione dei cloni generati mediante analisi FACS. Quindi, mettiamo a disposizione un protocollo dettagliato per la purificazione, la cultura e l'espansione ex vivo di cellule CD4 + Vδ1 + γδ cellule T. Questa conoscenza è condizione indispensabile per gli studi che riguardano questo αβT progenitor`s biologico cellula e per coloro che mirano a identify i trigger molecolari che sono coinvolti nel suo transdifferenziamento.
Introduction
Nei vertebrati, immunità adattativa che si struttura nel cellulare e una parte umorale di immunità svolge un ruolo importante nella difesa contro gli agenti patogeni. Il riconoscimento di una vasta gamma di antigeni è mediata da T- hyperpolymorphic e recettori cellulari B (TCR / BCR), che per quanto riguarda le cellule T sono assunti essere prodotta principalmente nel timo 1. A tale scopo, le cellule staminali ematopoietiche (CSE), derivate dal midollo osseo, il timo seme e differenziare lungo fasi ben definite finalmente danno origine a tutte le linee cellulari T. Thymus progenitori semina sono CD4 – e CD8 – e costituiscono quindi la frazione timocita immaturo, doppio negativo (DN). Segnali Thymus derivate poi inducono il loro impegno lignaggio e la differenziazione in cellule T αβ sia o γδ. L'espressione di funzionalmente riarrangiati TCR-gamma e TCR-δ catena geni in DN2 / 3 timociti porta a γ δTCR complessi, che guidano la proliferazione cellulare und promuovere la differenziazione in cellule γ DT 2,3. Al contrario, il riarrangiamento di un funzionale catena TCR-β, che può accoppiarsi con preTα costruire una preTCR pT, induce il silenziamento trascrizionale della catena TCR-γ in timociti DN3 e il loro inserimento CD4 + CD8 + doppio positive timociti 4 . In questa fase, la ricombinazione della catena TCR-α si verifica, eliminando il locus TCR-δ che annida nel locus TCR-α, abrogando quindi la produzione di un γδTCR in queste cellule irrevocabilmente 5-9. ΑβTCRs riarrangiati sono successivamente selezionati per la loro capacità di legarsi auto-MHC debolmente (selezione positiva), che non può superare una certa soglia per evitare autoimmunità (selezione negativa). Secondo la loro capacità di I o II legame MHC di classe, le celle selezionate αβT si sviluppano in cellule singole positive CD4 + o CD8 +, che uscita il timo cellule T come naïve.
Tuttavia, involuzione del timo inizia presto nella vita che porta a esponenzialmente ridotto la produzione di cellule T naive che è quasi estinta dopo l'adolescenza 10. Tuttavia, la dimensione del pool di cellule T rimane costante per tutta la vita, che può essere spiegato solo in parte dal post-timica proliferazione omeostatica di cellule T e la proliferazione di lunga durata memoria immunologica 11. Di conseguenza, deve avvenire lo sviluppo extrathymic cellule T. La ricerca recente ha acquisito notevole attrazione che caratterizza progenitori delle cellule αβT che-a-extrathymic siti hanno dato origine alla αβ funzionale cellule T 12-17. Eppure, conoscenza dettagliata extrathymic precursori delle cellule αβT che indipendente da un timo differenziarsi in cellule αβT è frammentaria come i precedenti che abbiamo sulla rotta prendono così.
Recentemente abbiamo identificato la piccola impresa a cellule T di Vδ1 + </sup> CD4 + γδT come un extrathymic prognitor cella αβT 18, che una volta isolato dal sangue periferico di donatori umani sani possono transdifferenziarsi in cellule αβT in un ambiente infiammatorio lieve. È interessante notare che e contrario alla proliferazione omeostatica delle cellule T post-timo, transdifferenziazione di cellule CD4 + Vδ1 genera nuovi recettori delle cellule T, ampliando così la diversità repertorio, in modo che potenzialmente nuovi antigeni possono essere riconosciuti e può tutela dell'ospite contro gli agenti patogeni di nuova acquisizione. Questo aggiunge alla plasticità delle cellule T e aggiunge un nuovo percorso finora unappreciated per lo sviluppo delle cellule T extrathymic.
L'isolamento quantitativo da fonti linfocitari, la generazione di cloni unicellulari e la loro espansione efficiente sono essenziali per l'obiettivo di individuare i marcatori e molecole che innescano questa cella αβT precursor`s sviluppo extrathymic.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per studiare il fenotipo, la biologia e la funzione di una scarsa (T) entità delle cellule, ovvero cellule Vδ1 + T CD4 +, abbiamo usato due marcatori: Vδ1 e CD4 per il suo isolamento positivo cella magnetica. Vδ1 è un recettore orfano, considerando CD4 è espresso sulle cellule T helper, ad un livello inferiore su monociti e cellule dendritiche, e ad un livello molto basso sulle cellule progenitrici ematopoietiche.
Tecniche per l'arricchimento e la selezione di celle a el…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Christian Welker is funded by a grant provided by the Jürgen-Manchot-Stiftung.
Materials
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
Referências
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F. Lymphocyte life-span and memory. Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
