Isolasjon og<em> Ex Vivo</em> Culture of Vδ1⁺ CD4⁺ γδ T Cells, en Extrathymic αβT-celle Progenitor

Summary

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Abstract

Thymus, den primære organ for generering av αβ T-celler og ryggraden i det adaptive immunsystemet hos virveldyr, har lenge vært ansett som den eneste kilde til αβT celler. Likevel begynner thymus involusjon tidlig i livet som fører til en drastisk redusert produksjon av naive αβT celler i periferien. Likevel kan selv hundreåringer bygge immunitet mot nyervervede patogener. Nyere forskning tyder extrathymic αβT celle utvikling, men vår forståelse av trasé som kan kompensere for thymic tap av funksjon er fortsatt rudimental. γδ T-celler er lymfocytter som medfødt som utgjør hoved T-celle-undersett i vevet. Vi har nylig tilskrevet en hittil lite verdsatt enestående funksjon til en γδ T-celle undersett ved å vise at knappe enhet av CD4 ⁺ Vδ1 γδ ⁺ T-celler kan transdifferentiate αβT inn i cellene i inflammatoriske tilstander. Her, vi pROVIDE protokollen for isolasjon av denne progenitor fra perifert blod og etterfølgende dyrking. Vδ1 celler er positivt anriket fra PBMC fra friske pasienter ved å bruke magnetiske kuler, etterfulgt av et andre trinn hvor vi målrette knappe fraksjon av ^CD4 + -celler med en ytterligere magnetisk merkingsteknikk. Den magnetiske kraft av den andre merking overstiger en av den første magnetiske etiketten, og således tillater effektiv, kvantitative og spesifikk positiv isolasjon av populasjonen av interesse. Vi introduserer så teknikken og dyrkingsbetingelser som kreves for kloning og effektivt å utvide cellene og for identifisering av de genererte kloner ved FACS-analyse. Dermed gir vi en detaljert protokoll for rensing, kultur og ex vivo utvidelse av CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ T-celler. Denne kunnskapen er en forutsetning for studier som er knyttet til denne αβT celle progenitor`s biologi og for de som tar sikte på å identify de molekylære triggere som er involvert i transdifferensiering.

Introduction

I virveldyr, adaptiv immunitet som er strukturert i mobilnettet og en humoral del av immunitet spiller en stor rolle i forsvaret mot patogener. Erkjennelsen av et bredt spekter av antigener medieres av hyperpolymorphic T- og B-cellereseptorer (TCR / BCR), som med hensyn til T-celler antas å bli produsert hovedsakelig i thymus ^1. Dertil, blodkreft stamceller (HSCs), avledet fra benmarg, frø thymus og differensiere sammen veldefinerte faser endelig gir opphav til alle T-celle linjene. Thymus seeding stamfedre er CD4 ^– og CD8 ^– og utgjør dermed den umodne, dobbel negativ (DN) thymocytt brøkdel. Thymusavledede signaler deretter indusere sin avstamning engasjement og differensiering til enten αβ eller γδ T-celler. Uttrykket av funksjonelt omorganisert TCR-y og TCR-S kjede gener i DN2 / 3 tymocytter fører til y δTCR komplekser, som driver celleproliferasjonstest end fremme differensiering i γ At celler ^2,3. I motsetning til dette rearrangement av en funksjonell TCR-β-kjeden, som kan sammenkobles med preTα å bygge en preTCR pT, induserer transkripsjons stanse av den TCR-γ kjeden i DN3 thymocytter og deres overgang til CD4 ⁺ CD8 ⁺ dobbelt-positive thymocytter ⁴ . På dette stadium, rekombinasjon av den TCR-kjede α inntreffer, sletter den TCR-δ locus som ligger godt innenfor den TCR-α locus, således lertid produksjons en γδTCR i disse cellene ugjenkallelig ^5-9. Rearrangert αβTCRs blir deretter valgt for sin evne til å binde selv-MHC svakt (positiv seleksjon), som ikke kan overstige en viss terskelverdi for å unngå autoimmunitet (negativ seleksjon). Ifølge deres evne til å binde MHC klasse I eller II, de valgte αβT celler utvikle seg til single-positive CD4 ⁺ eller CD8 ⁺ T-celler, som exit thymus som naive T-celler.

Men involusjon av thymus starter tidlig i livet fører til eksponentielt redusert produksjon av naive T-celler som er nesten slukket etter oppvekst ^10. Ikke desto mindre er størrelsen av T-celle basseng holdes konstant gjennom hele livet, noe som kan forklares bare delvis av post-tymisk homeostatisk proliferasjon av T-celler og spredning av langlivede immunologisk hukommelse ^11. Følgelig må extrathymic T-celleutvikling oppstår. Nyere forskning har fått betydelig attraksjon som preget αβT cellestamfedre, som-at extrathymic sider-ga opphav til funksjonell αβ T-celler ^12-17. Likevel er detaljert kunnskap om extrathymic αβT celle forløpere som uavhengig fra en thymus differensiere i αβT celler som fragmentarisk som bakgrunn at vi har på ruten de tar dermed.

Vi har nylig identifisert den lille T-celle enhet av Vδ1 ⁺ </sup> CD4 ⁺ celler som γδT en extrathymic αβT celle prognitor ^18, som da er isolert fra perifert blod fra friske pasienter kan transdifferentiate inn αβT celler i en mild inflammatorisk miljø. Interessant og i strid med homeostatic spredning av post-thymic T-celler, transdifferensiering av Vδ1 ^CD4 + celler genererer nye T cellereseptorer, og dermed utvide repertoaret mangfold, slik at potensielt nye antigener kan bli gjenkjent og kan beskytte verten mot nyervervede patogener. Dette legger til plastisitet av T-celler og gir en hittil lite verdsatt ny vei for extrathymic T-celleutvikling.

Den kvantitative isolasjon fra lymfocyttiske kilder, generering av encellede kloner og deres effektiv ekspansjon er avgjørende for målet å identifisere disse markørene og molekyler som utløser denne αβT celle precursor`s extrathymic utvikling.

Protocol

Moral Uttalelse: Alle prosedyrer ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen, og ble godkjent av klinisk etikk-komité ved Universitetet i Tübingen (prosjekter 38 / 2009B02 og 470 / 2013B02). 1. Isolering av perifere mononukleære blodceller (PBMC) Ta 50-100 ml fra en frisk frivillig via venepunktering ved anvendelse av en 50 ml sprøyte inneholdende 1000 IE heparin-sulfat og fortynne blodet 1: 2 med PBS (pH = 7,2). Nøye lag 35 ml av blod: PBS-oppløsning på 15 ml…

Representative Results

Figur 1 viser de forskjellige stadier og resultatet av isolering av Vδ1 T-celler fra perifert blod. Figur 1A viser en typisk fordeling av Vδ1 + -celler i CD3 + lymfocytter, så vel som ko-reseptor ekspresjon av Vδ1 + populasjonen. I denne donor, er frekvensen av Vδ1 + -celler (rød) 2,3% av totalt antall lymfocytter og CD4-ekspresjon (grønn) av Vδ1 + lymfocytter er 2,6%. Til sammen representerer målgruppen for isolering 0,06%…

Discussion

For å studere fenotype, biologien og funksjonen av en knapp (T-) celleenhet, nemlig Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ -T-celler, benyttes det to markører: Vδ1 og CD4 for sin positive magnetiske celleisolasjon. Vδ1 er frittstående reseptor, mens CD4 uttrykkes på T-hjelperceller, på et lavere nivå på monocytter og dendrittiske celler, og på et meget lavt nivå på hematopoetiske stamceller.

Teknikker for anriking og seleksjon av celler i høy renhet inkluderer fluorescensaktivert ce…

Materials

Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D