İzolasyon ve<em> Ex Vivo</emVδ1 of> Kültür<sup> +</sup> CD4<sup> +</sup> γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör
Summary
Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.
Abstract
Timus, αβ T hücreleri ve omurgalılarda adaptif bağışıklık sisteminin omurgasının oluşturulması için primer organ uzun αβT hücrelerinin tek kaynak olarak kabul edilmiştir. Ancak, timik involüsyon çevresine naif αβT hücrelerinin büyük ölçüde azalır çıkış lider hayatında erken başlıyor. Yine de, hatta asırlık yeni alınan patojenlere karşı bağışıklık inşa edebilirsiniz. Son araştırmalar fonksiyonunun timus kaybını telafi edebilir yolların ancak bizim anlayış hala rudimental olan extrathymic αβT hücre gelişimini göstermektedir. γδ T hücreleri dokularda temel T-hücresi alt kümesi oluşturur doğuştan lenfositlerdir. Biz son zamanlarda göstererek bir γδ T hücre alt kümesine bir şimdiye kadar farkedilmemiş seçkin işlevi atfedilen o CD4 kıt varlık + Vδ1 + γδ T hücreleri inflamatuar koşullarda αβT hücrelerin içine transdifferentiate olabilir. Burada, biz pperiferik kandan bu dede izolasyonu ve sonraki ekimi için protokol rovide. Vδ1 hücreleri pozitif bir başka manyetik işaretleme tekniği ile CD4 + hücrelerinin az kısmını hedef olup, burada, bir ikinci aşamada, ardından manyetik boncuklar kullanılarak Sağlıklı insan donörlerden bir PBMC'lerden zenginleştirilmiştir. İkinci etiketleme manyetik kuvvet ilk manyetik etiket biri aşıyor ve bu nedenle faiz nüfusunun, verimli nicel ve belirli olumlu izolasyonu sağlar. Daha sonra hücreler, klonlama ve verimli bir şekilde genişletilmesi için ve FACS analizi ile üretilmiştir klonlarının tespiti için gerekli olan teknik ve kültür durum getirmektedir. Böylece, saflaştırma, kültür ve CD4 + Vδ1 + γδ T hücrelerinin ex vivo artışı için detaylı bir protokol sağlar. Bu bilgi, bu αβT hücre progenitor`s biyoloji ile ilgili çalışmalara ve ide amaçlayan olanlar için ön koşuldurBunu transdiferansiyonun yer alan moleküler tetikler ntify.
Introduction
Omurgalılarda, hücresel ve bağışıklığın bir hümoral bölümünde yapılandırılmıştır adaptif bağışıklık patojenlere karşı savunmasında önemli bir rol oynar. Antijenleri geniş bir tanıma, T hücreleri ile ilgili olarak timus 1 esas olarak üretilecek varsayılır hyperpolymorphic T ve B hücresi reseptörlerinin (TCR / BCR), aracılık eder. Bunun üzerine, kemik iliğinden elde edilen hematopoetik kök hücrelerin (HSC), timus tohum ve nihayet tüm T hücre soyları sebebiyet veren iyi tanımlanmış aşamaları boyunca ayırt. Ve CD8 – – Thymus ekim atalarıdır CD4 ve böylece olgunlaşmamış, çift negatif (DN) timosit kısmını oluşturmaktadır. Thymus türetilmiş sinyaller daha sonra soy bağlılığı ve αβ veya γδ T hücrelerinin içine ya farklılaşmasını teşvik. DN2 / 3 timositlerde fonksiyonel olarak yeniden düzenlenmiş TCR-γ ve TCR-δ zincir genlerinin sentezlenmesi selüler proliferasyon, bir sürücü δTCR kompleksleri, y olan yol açarγ ¨t hücrelerine 2,3 içine farklılaşmasını teşvik d. Buna karşılık, bir preTCR pT oluşturmak için preTα eşleştirmeden işlevsel TCR-β zincirinin yeniden düzenlenmesi, transkripsiyon DN3 timositlerde TCR-γ zincirinin susturulması ve CD4 + CD8 + çift pozitif timositleri 4 içine geçiş indükler . Bu aşamada, TCR-α zincirinin rekombinasyon ve böylece, bu hücrelerin geri dönülmez 5-9 üretim, bir γδTCR ortadan kaldıran, TCR-α lokusundaki sırtını TCR-δ lokusunu silme oluşur. Rearranged αβTCRs sonradan otoimmünitesini (negatif seçim) önlemek için belirli bir eşiği geçemez zayıf (pozitif seçimi) öz-MHC bağlanma yetenekleri için seçilir. MHC sınıf I veya II bağlama kapasitelerine göre, seçilen αβT hücreler tek-pozitif CD4 + veya CD8 + T hücreleri, timus çıkış naif T hücreleri dönüşür.
Ancak, timus involusyonu erken neredeyse söndürülmüş sonrası ergenlik 10 naif T hücrelerinin katlanarak azaltılmış çıkış yol açan yaşam başlar. Bununla birlikte, T hücresi havuzunun büyüklüğü sonrası timik homeostatik T hücrelerinin çoğalması ve uzun ömürlü immünolojik bellek 11 proliferasyonu ile sadece kısmen açıklanabilir ömrü boyunca sabit kalır. Sonuç olarak, T-hücresi gelişimi extrathymic gerçekleşmelidir. Son zamanlarda yapılan araştırmalar-de extrathymic fonksiyonel αβ T hücrelerinin 12-17 yol siteleri-verdi αβT hücre atalarıdır, karakterize önemli cazibe kazanmıştır. Oysa, bir timus bağımsız αβT hücrelerine ayırt extrathymic αβT hücre öncüleri hakkında detaylı bilgi biz onlar böylece almak güzergahı üzerinde olan arka plan olarak bölük pörçük olduğunu.
Biz son zamanlarda Vδ1 + küçük T-hücre varlık tespit </sup> hafif inflamatuar ortamında αβT hücrelerine transdifferentiate sağlıklı insan vericilerden periferal kandan izole edilen bir extrathymic αβT hücre prognitor 18 olarak CD4 + γδT hücreleri. İlginç bir şekilde ve potansiyel olarak yeni antijenler kabul edilebilir, böylece bu şekilde, repertuarı genişleyen çeşitlilik sonrası timik T hücrelerinin proliferasyonu homeostatik, Vδ1 CD4 + hücrelerinin transdiferansiyonun yeni T hücre reseptörleri üreten, aksine ve koruma olabilir yeni alınan patojenlere karşı konakçı. Bu T hücrelerinin plastisite ekler ve extrathymic T hücre gelişimi için şimdiye kadar farkedilmemiş yeni yolu ekler.
Amaç bu αβT hücresi extrathymic gelişimini precursor`s tetikleyen işaretleri ve molekülleri tanımlamak için lenfositik kaynaklardan niceliksel izolasyonu, tek hücre klonlarının oluşturulması ve etkin genişletme gereklidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pozitif manyetik hücre izolasyonu için Vδ1 ve CD4: kıt (T-) hücre varlığın fenotip, biyoloji ve işlevini incelemek için, yani Vδ1 + CD4 + T hücreleri, iki işaret kullanılır. CD4 monositler ve dendritik hücreler üzerinde daha düşük bir seviyede, T yardımcı hücreleri üzerinde ifade edilen ve hematopoietik progenitör hücreler üzerindeki çok düşük bir seviyede, oysa Vδ1, yetim reseptörüdür.
Yüksek saflıkta hücrelerin zenginleştirilmesi ve seçim …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Christian Welker is funded by a grant provided by the Jürgen-Manchot-Stiftung.
Materials
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
Referências
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F. Lymphocyte life-span and memory. Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
