Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Summary

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Abstract

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.

In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Introduction

De mogelijkheid om de cellulaire activiteit een nauwkeurige ruimtelijke en temporele resolutie manipuleren is een belangrijke strategie neurowetenschappelijk onderzoek en bij de behandeling van neurologische en psychiatrische stoornissen. ¹ traditionele methoden berusten op elektrische stimulatie van cellen met behulp positioneringen nabijheid of in contact met het beoogde systeem ² die kunnen van verschillende complexiteit (enkele cel, cellulair netwerk hersencoupes in-vivo hersenweefsel). Tijdens de afgelopen eeuw, hebben het gebruik van de patch-clamp, metaal en substraat geïntegreerde elektroden een gedetailleerd beeld van de fysiologie en pathofysiologie van enkele neuronen en van de werkingsmechanismen van neurale netwerken voorzien. Echter, elektrische stimulatie lijdt aan belangrijke beperkingen. De eerste heeft betrekking op een algemeen slechte ruimtelijke resolutie door de fysieke afmetingen van de elektroden en hun vaste geometrie, die niet gemakkelijk kan worden aangepastcomplexe bestuurde achtige biologische weefsels. Ook kunnen problemen met de elektroden impedantie en overspraak tussen stimulatie en opnamesystemen de uiteindelijke signaal-ruisverhouding van de meting afnemen. ³ Aan de andere kant kan het gebruik van licht voor het stimuleren helpen vele beperkingen te overwinnen van de elektrische benadering. Ten eerste biedt het ongekende ruimtelijke (<1 um) en temporele resolutie (<1 msec), waardoor specifieke celtypen of zelfs sub-celcompartimenten richten. Bovendien is sterk niet-invasief aangezien het vermijdt contact komen met het weefsel van belang en ontwart stimulatie van opname. Bovendien kunnen zowel lichtsterkte en de golflengte nauwkeurig worden geregeld en daarmee diverse stimulatie protocollen kunnen worden toegepast. ^3,4

Echter, de meeste dierlijke cellen geen specifieke lichtgevoeligheid presenteren. Verschillende strategieën voor optische stimulation zijn dus voorgesteld, hetzij benutten lichtgevoelige moleculaire mediatoren nabij of binnen de cellen of middels fotoactieve extern apparaat geplaatst nabij de cel. De eerste categorie betreft endogene mechanismen zoals stimulatie via zichtbaar of infrarood (IR) licht, alsmede het gebruik van hetzij fotoisomeriseerbare / splitsbare verbindingen of de genetische expressie van lichtgevoelige moleculaire actuators (optogenetics). De laatste klasse omvat technieken exogene stimulering bereikt met het gebruik van anorganische nano / micro-deeltjes of fotogeleidende siliciumsubstraten. ⁵ Desalniettemin, al deze systemen lichte kanten en nadelen. Vooral endogene opname van cellen in het zichtbare gebied zwak en onbetrouwbaar, en de gelijktijdige vorming van reactieve zuurstofsoorten kan schadelijk zijn voor de cel. In het algemeen wordt IR gebruikt voor het induceren van lokale thermische opwarming door waterabsorptie, maar de extinctiecoëfficiënt van water klein is, waardoor het nodig strong infrarood licht (van tientallen tot honderden W / mm ²⁾ dat moeilijk te leveren via standaardmicroscoop optica en kunnen veiligheidsoverwegingen in vivo toepassingen opleveren. Anderzijds, foto-schakelbare kooien verbindingen hebben een tijd beperkte werking en vereisen vaak UV licht dat moeilijk te leveren als gevolg van beperkte weefselpenetratie. Verder zij lijden aan diffusieprobleem van de geactiveerde verbindingen bij fotolyse buiten de verlichte zone. Tenslotte hebben optogenetic hulpmiddelen mogen wetenschappers subpopulatie specifieke cellulaire en sub-compartimenten targeten en worden sterk opkomende als een van de belangrijkste technologieën neurowetenschappelijk onderzoek. Echter, het inbrengen van een exogeen DNA-segment via een virale vector roept belangrijke veiligheidskwesties, met name met het oog op goedkeuring op menselijke patiënten. ^5,6 Om deze redenen, onderzoek naar nieuwe materialen en apparaten staat cel optische manipulatie is een zeer hot topic.

Onlangs is een nieuwaanpak gebaseerd op het gebruik van lichtgevoelige geconjugeerde polymeren, efficiënt kunnen transduceren optische stimulus in een modulatie van cel elektrische activiteit, is voorgesteld. De cel stimulatie door Polymer fotoexcitatie (CSPP) techniek maakt gebruik van een groot aantal key-enabling typische kenmerken van organische halfgeleiders: ze zijn intrinsiek gevoelig voor licht in het zichtbare ^gebied, 7 ze zijn biocompatibel, zacht en gelijkvormig en hun mechanische flexibiliteit maakt een intieme-interface met weefsel zowel in-vitro pt in-vivo ^8-10. Daarnaast, kunnen zij gemakkelijk worden gefunctionaliseerd om beter aan te passen aan de interface met levende cellen en specifieke excitatie schakelen indringende en sensing capaciteiten. ^11,12 Bovendien ondersteunen zij zowel elektronische als ionentransport, waardoor ze ideaal voor de combinatie Elektronica ad biologie. ^13,14 Interessant is dat ze werken in fotovoltaïsche modus, het vermijden van de noodzaak een extern voorspanning f toepassingof efficiënte cel optische stimulatie. ¹⁵

De betrouwbaarheid van CSPP techniek is eerder aangetoond in diverse systemen, waaronder primaire neuronen, ^15,16 astrocyten, ¹⁷ secundaire cellijnen ^{18 en} geëxplanteerd netvlies weefsels. ¹⁶ In dit werk, alle stappen die nodig zijn om een lichtgevoelige bio-polymeer fabriceren -interface ¹⁹ voor optische stimulatie van in vitro-systemen worden beschreven. Als een studie geval een prototypische organische fotovoltaïsche mix van regio-reguliere poly (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), functioneren als het elektron donor, en fenyl-C61-boterzuur-zuur-methyl ester (PCBM), als de elektronenacceptor wordt toegepast. Als het biologische systeem, zijn humane embryonale nier (HEK-293) cellen gebruikt. Een voorbeeld van een fotostimulering protocol met de relatieve opname van celactiviteit via elektrofysiologische metingen wordt geleverd.

De beschreven platformechter algemene geldigheid, en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar het gebruik van andere geconjugeerde polymeren (door juiste instelling van de oplossing voorbereidingsproces en de depositie parameters), verschillende celtypen (door naar behoren het veranderen van de celkweek protocol, plating procedure en de gevraagde voor mobiele zaaien en proliferatie) en verschillende stimulatie protocollen (licht golflengte, stimuli frequentie en duur, foto-excitatie dichtheid).

Protocol

1. Voorbereiding van Fotoactieve Substrates Bereid een P3HT: PCBM oplossing (1: 1 w / w) in chloorbenzeen bij een P3HT concentratie van 20 g / l. Meng de oplossing met een magnetische roerder gedurende ten minste 4 uur bij 60 ° C. Beschouw een volume van 150 ul oplossing voor elk substraat te bereiden. Clean-ITO beklede objectglaasjes (Rs = 10 Ω / vierkant, 18×18 mm 2, dikte 170 pm) met opeenvolgende baden gedeïoniseerd water, aceton en isopropanol in een sonicator (10 min v…

Representative Results

Cellen kunnen eenvoudig worden gekweekt op P3HT: PCBM substraten, mits er een geschikte hechtlaag is aangebracht (zoals fibronectine gebruikt in stap 3.2 van de beschreven protocol). P3HT: PCBM optische absorptie pieken in het groene deel van het zichtbare spectrum; maar andere lichtgevoelige geconjugeerde polymeren kunnen worden geselecteerd volgens de gewenste fotostimule- golflengte bereik (figuur 2). Biocompatibiliteit van deze substraten is aangetoond niet alleen ce…

Discussion

Kritische stappen van de gerapporteerde protocol voor in-vitro optische stimulatie van cellen voornamelijk betrekking op de keuze van de lichtgevoelige polymeer, de thermische sterilisatie parameters, de intensiteit en de duur van het licht stimuli. Een P3HT: PCBM dunne film werd hier gekozen, omdat het garandeert een goede tijd en elektrochemische stabiliteit. Echter, men moet opmerken dat niet alle lichtgevoelige polymeren analoge optredens meer specifiek kan bieden, ²² bij belichting. Bovendien, i…

Materials

rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO-coated substrates	Nano-CS	IT10300100
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
chlorobenzene	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetone	Sigma Aldrich	270725
isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	563935
HEK cells	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-
FBS	LGC standards srl	ATCC-30-2020