HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Eksozomlar hücre tipleri çok çeşitli hem yapısal olarak ve uyarım üzerine salınan olan 30 nm ile 100 nm arasında değişen büyüklükte küçük veziküllerdir. Bunlar, biyolojik sıvılarla bir dizi bulunmuştur ve bu proteinler, lipidler ve nükleik asit molekülleri, çeşitli taşıdığı bilinmektedir. Başlangıçta hücresel enkaz için rezervuarların daha az biyolojik süreçleri düzenleyen eksozom ve hastalıkları rolleri giderek takdir edilmektedir olduğu düşünülen.
Çeşitli yöntemler, hücresel kültür ortamı ve biyolojik sıvılardan izole etmek için eksozomlar tarif edilmiştir. Nedeniyle, küçük boyut ve düşük yoğunluk, ayırıcı ultra-santrifüj ve / veya ultra filtre eksozom izolasyonu için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, HIV-1 bulaşmış kişilerin plazma büyüklüğüne ve yoğunluğuna içindeki hem eksozomlar ve HIV viral partikülleri içerir. Bu nedenle, insan plazmasında HIV viral parçacıklardan eksozom etkin ayrılması olmuşturmeydan okuma.
Bu sınırlama gidermek için, Cantin et tadil edilen bir prosedür geliştirilmiştir. al., insan plazmasında HIV parçacıklardan eksozom saflaştırılması için 2008. Iyodiksanol gradyanları hızı, HIV-1 pozitif bireylerin plazmasındaki HIV-1 parçacıklardan eksozomlar ayırmak için kullanıldı. Virüs partikülleri p24 ELISA ile tespit edilmiştir. Eksozomlar eksozom belirteçleri asetilkolinesteraz temelinde (AChE) ve CD9, CD63, ve CD45 antijenleri üzerinde belirlenmiştir. Bizim degrade prosedürü virüs parçacıklarının serbest eksozom hazırlıklarını vermiştir. Insan plazmasından eksozomlann verimli arıtma plazma türevi eksozom içeriğini incelemek ve bağışıklık düzenleyici potansiyeli ve diğer biyolojik fonksiyonlarını araştırmak sağladı.
Introduction
HIV-1 salgını dünya çapında önemli bir etkiye sahip devam ediyor. 2013 yılı itibariyle, dünya genelinde yaklaşık 35 milyon kişi HIV ile yaşadığı ve bunlardan 2,1 milyon yeni enfekte bireyler 1 idi. Önleme stratejileri ve antiretroviral tedaviye artan erişim HIV genel edinimini azaltmada yararlı olmuştur. Ancak, bireysel popülasyonları halen HIV 1 edinimi yükselir yaşıyoruz. Bu nedenle, bu salgının ele almaya devam çabaları için bir ihtiyaç vardır.
HIV hastalığın ilerlemesi güçlü belirleyicileri biri kronik immün aktivasyon (CIA) 2-10 olduğunu. Saptanabilir sitokinler ve T lenfositlerinin yüzeyinde yükseltilmiş ifade belirteçleri sürekli olarak yüksek seviyelerde tarafından tanımlanan, CIA sanılıyor: Ben 11 IFN Tip i) sürekli dendritik hücre üretimi; HIV proteinleri Tat, Nef ve gp120 12 tarafından tahrik edilen, (ii) direkt immün aktivasyon; (iiiGut ilişkili bağışıklık hücreleri 6 bakteriyel proteinlerin) translokasyonu. Ancak, tam mekanizması (ler) altında yatan kronik HIV enfeksiyonu sistemik bağışıklık aktivasyon tam olarak aydınlatılamamıştır beklemektedir.
Araştırma grubumuz ve diğerleri HIV patogenezinde 15-18 yılında eksozomlann rol göstermiştir. Bizim grup Nef proteini eksozom 15, enfekte hücrelerden salgılanan olduğunu belirlemiştir ve exosomal Nef (exNef) nanogram seviyeleri 18 HIV bulaşmış kişilerin plazmasında mevcut bulunmaktadır. Bu alternatif olarak, monosit / makrofajlar exNef kaynaklı apoptosise karşı kolay işlenemezdir. ExNef maruz CD4 + T-hücreleri, CXCR4 yolunun 19, 20 bağlıdır aktivasyonu ile indüklenen hücre ölümü sonuçlandı oradan geçmekte göstermiştir, fakat değiştirilmiş hücresel fonksiyonları ve sitokin ekspresyonunu sergilemişlerdir. HIV ile infekte olmuş bireylerin plazmasındaki izole Son zamanlarda, bir grup göstermiştir eksozomlar pro-enflamatuar sitokinlerin çeşitli içerir. Further, saf ve merkezi bellek CD4 + ve CD8 + T hücreleri üzerinde CD38 ekspresyonunu indüklediği HIV bulaşmış hastalarda plazma türevi eksozom maruz saf periferal kan tek-çekirdekli hücreleri. Bu büyük olasılıkla sistemik inflamasyon ve seyirci hücre aktivasyonu 21 üzerinden viral yayılma katkıda bulunur ve eksozomlar HIV patogenezinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir.
HIV patogenezinde eksozomlann rolünü araştıran, bir meydan HIV parçacıklar verimli ayrı eksozomlar exosomal içeriği korurken yanı sıra işlevsel immün modülatör yeteneği teknikleri geliştiriyor. Çeşitli yöntemler, hücre kültürü ve biyolojik sıvılarda 22,23 den eksozomlar izole etmek için tarif edilmiştir. Çünkü küçük boyutları ve düşük yoğunluklu (eksozomlar 1.15 yoğunluğunda yüzer – 1.19 g / ml), ayırıcı ultrasantrifüjleme ve / veya ultrafiltrasyon eksozom izolasyonu 23 için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir.Bununla birlikte, HIV ile infekte olmuş hücre kültürü süpernatanları, hastaların plazma eksozomlar ve HİV-1 virüs partiküllerini içerir. Eksozomlar ve HİV-1 parçacıkların boyutu ve yoğunluğu açısından oldukça benzerdir. Seçenek olarak ise, örneğin CD63, CD45 ve CD81 gibi benzersiz exosomal markerlerin ekspresyonu yararlanarak, eksozomlar immünoafinite yakalama yöntemleri 23 kullanılarak izole edilmiştir. Bu prosedür eksozom virüsü ayırabilirsiniz. Bununla birlikte, bu tekniğin dezavantajı, kültür eksozomlann bağışıklık potansiyelinin değerlendirilmesi ile etkileşime girebilir saflaştırılmış eksozom, antikorların sıkı ektir.
Bu sınırlamaları için, iyodiksanol gradyanları kullanılarak hızı HIV Cantin modifiye insan plazması içinde parçacıklar ve arkadaşları 22 eksozomlann saflaştırılması için bir yöntem geliştirdi. Virüs parçacıkları yüksek- içinde ayrılmış oysa eksozomlar, düşük yoğunluk iyodiksanol geçişlerini / üst fraksiyonları ayırmak bulunduyoğunluk / düşük kesirler. Virüs partikülleri p24 ELISA ile belirlenmiştir ve eksozomlar eksozom işaretleri AChE, CD9, CD63, ve CD45 ile tespit edilmiştir. Toplanan üst düşük yoğunluklu parçacıkları HİV-1 p24 kirlenme için negatifti eksozomlar ihtiva etmiştir. Insan plazması HIV parçacıklardan eksozom etkin bir biçimde saflaştırılabilir ve ayırma insan plazması gibi bağışıklık modülatör potansiyelinin incelenmesi ve HIV-1 patojenezinde eksozom tanısal ve prognostik değerinden türetilen bir eksozom içeriği doğru inceleme sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kronik immün aktivasyon (CIA) ve CD4 + T hücresi kaybı, HIV-1 enfeksiyonunun iki önemli özellikleridir. Onlar CIA iyi belirleyicisi olmak, patogenezi için belirleyicileri olarak kurulmuştur. Ancak, kronik sistemik immün aktivasyon ve CD4 + T hücre düşüş sürüş altında yatan mekanizmaları hala tam olarak ortaya konamamıştır. Bu ve diğer laboratuar HIV-1 ile enfekte hücrelerden salgılanan eksozomlar iki özelliklerinden önemli bir rol oynadığını sağlam kanıtlar geliştirdik.
<p class="jov…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
Referências
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). . UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O’Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
