एचआईवी -1 सकारात्मक व्यक्तियों के प्लाज्मा से Exosomes का अलगाव
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Exosomes सेल प्रकार की एक किस्म से दोनों अनिवार्यता और उत्तेजना पर जारी कर रहे हैं कि 30 एनएम से 100 एनएम से आकार में लेकर छोटे पुटिकाओं हैं। वे जैविक तरल पदार्थ की एक संख्या में पाए जाते हैं और प्रोटीन, वसा, और न्यूक्लिक एसिड अणुओं की एक किस्म ले जाने के लिए जाना जाता है। मूलतः सेलुलर मलबे के लिए जलाशयों से थोड़ा अधिक है, जैविक प्रक्रिया का विनियमन exosomes की और रोगों में भूमिका तेजी से सराहना कर रहे हैं होने लगा।
कई तरीकों सेलुलर संस्कृति मीडिया और जैविक तरल पदार्थ से exosomes अलग-थलग करने के लिए वर्णित किया गया है। कारण उनके छोटे आकार और कम घनत्व, अंतर ultracentrifugation और / या ultrafiltration को exosome अलगाव के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीकों हैं। हालांकि, एचआईवी -1 से संक्रमित व्यक्तियों के प्लाज्मा आकार और घनत्व में समान हैं, जो दोनों exosomes और एचआईवी वायरल कणों, शामिल हैं। इस प्रकार, मानव प्लाज्मा में एचआईवी वायरल कणों से exosomes के कुशल जुदाई किया गया हैएक चुनौती।
इस सीमा को संबोधित करने के लिए, हम Cantin एट से संशोधित एक प्रक्रिया विकसित की है। अल।, मानव प्लाज्मा में एचआईवी के कणों से exosomes की शुद्धि के लिए 2008। Iodixanol वेग ढ़ाल एचआईवी -1 सकारात्मक व्यक्तियों के प्लाज्मा में एचआईवी -1 कणों से exosomes अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया। वायरस कणों पी 24 एलिसा द्वारा की पहचान की गई। Exosomes exosome मार्कर एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ के आधार (दर्द), और CD9, CD63, और CD45 एंटीजन पर पहचान की गई। हमारी ढाल प्रक्रिया वायरस कणों से मुक्त exosome तैयारियों झुकेंगे। मानव प्लाज्मा से exosomes के कुशल शुद्धि प्लाज्मा व्युत्पन्न exosomes की सामग्री की जांच करने के लिए और उनकी प्रतिरक्षा modulatory क्षमता और अन्य जैविक कार्यों की जांच करने के लिए सक्षम होना चाहिए।
Introduction
एचआईवी -1 महामारी दुनिया भर में एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है करने के लिए जारी है। 2013 के रूप में, दुनिया भर में लगभग 35 लाख लोग एचआईवी के साथ जी रहे थे, और इनमें से 2.1 लाख नव संक्रमित व्यक्तियों के एक थे। रोकथाम रणनीति और एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी तक पहुंच बढ़ाने एचआईवी के समग्र अधिग्रहण को कम करने में मददगार दिया गया है। हालांकि, व्यक्तिगत आबादी अभी भी एचआईवी 1 के अधिग्रहण में उगता सामना कर रहे हैं। इस प्रकार, इस महामारी से निपटने के लिए जारी प्रयासों के लिए एक की जरूरत है।
एचआईवी रोग प्रगति की सबसे मजबूत predictors में से एक पुरानी प्रतिरक्षा सक्रियण (सीआईए) 2-10 है। पहचाने जाने साइटोकिन्स और टी lymphocytes की सतह पर ऊंचा अभिव्यक्ति मार्करों के लगातार उच्च स्तर से परिभाषित किया, सीआईए को जिम्मेदार ठहराया गया है: मैं 11 IFN प्रकार i) निरंतर वृक्ष के समान कोशिकाओं के उत्पादन; एचआईवी प्रोटीन गूंथना, NEF और gp120 12 के द्वारा संचालित (ii) के प्रत्यक्ष प्रतिरक्षा सक्रियण; (Iiiपेट जुड़े प्रतिरक्षा कोशिकाओं 6 में बैक्टीरियल प्रोटीन का) translocation। हालांकि, सटीक व्यवस्था (एस) अंतर्निहित पुरानी, एचआईवी संक्रमण में प्रणालीगत प्रतिरक्षा सक्रियण पूरी तरह से स्पष्ट किया जा रह है।
हमारे शोध समूह और अन्य लोगों के एचआईवी रोगजनन 15-18 में exosomes की भूमिका का प्रदर्शन किया है। हमारे समूह Nef प्रोटीन exosomes 15 में संक्रमित कोशिकाओं से उत्सर्जित किया जाता है कि निर्धारित किया गया है, और exosomal NEF (exNef) nanogram स्तर 18 पर एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों के प्लाज्मा में मौजूद है। हम वैकल्पिक रूप से, एककेंद्रकश्वेतकोशिका / मैक्रोफेज exNef-प्रेरित apoptosis को आग रोक थे। ExNef के संपर्क में सीडी 4+ टी कोशिकाओं CXCR4 मार्ग 19, 20 पर निर्भर सक्रियण प्रेरित सेल मौत हुई कि दर्शक दिखाया गया है, लेकिन बदल सेलुलर कार्यों और साइटोकाइन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया है। एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों के प्लाज्मा से अलग अभी हाल ही में हमारे समूह ने दिखा दिया है exosomes समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की एक किस्म के होते हैं। फूrther, भोले और केंद्रीय स्मृति सीडी 4 + और CD8 + टी कोशिकाओं पर CD38 की अभिव्यक्ति प्रेरित एचआईवी संक्रमित रोगियों से प्लाज्मा व्युत्पन्न exosomes के संपर्क में भोले परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear। यह संभावना प्रणालीगत सूजन और दर्शक सेल सक्रियण 21 के माध्यम से वायरल प्रसार में योगदान देता है, और exosomes एचआईवी रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि पता चलता है।
एचआईवी रोगजनन में exosomes की भूमिका की जांच में, एक चुनौती एचआईवी कणों से कुशलता से अलग exosomes exosomal सामग्री को बनाए रखते हुए साथ ही उनके कार्यात्मक प्रतिरक्षा modulatory क्षमता के लिए तकनीक विकसित कर रहा है। कई तरीकों सेल संस्कृति और जैविक तरल पदार्थ 22,23 से exosomes अलग-थलग करने के लिए वर्णित किया गया है। क्योंकि उनके छोटे आकार और कम घनत्व की (exosomes 1.15 के घनत्व पर तैरने लगते हैं – 1.19 ग्राम / एमएल), अंतर ultracentrifugation और / या ultrafiltration exosome अलगाव 23 के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीकों हैं।हालांकि, एचआईवी संक्रमित कोशिका संस्कृति supernatants और मरीजों के प्लाज्मा exosomes और एचआईवी -1 वायरल कणों दोनों होते हैं। Exosomes और एचआईवी -1 कणों का आकार और घनत्व दोनों में बहुत समान हैं। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के CD63, CD45, और CD81 के रूप में अद्वितीय exosomal मार्करों की अभिव्यक्ति का लाभ लेने, exosomes immunoaffinity कब्जा तरीकों 23 उपयोग कर अलग कर दिया गया है। यह प्रक्रिया exosomes से वायरस को अलग नहीं कर सकता। हालांकि, इस तकनीक का दोष यह है कि संस्कृति में exosomes की इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमता के आकलन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, जो शुद्ध exosomes, के लिए एंटीबॉडी की तंग लगाव है।
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम iodixanol वेग ढ़ाल का उपयोग एचआईवी Cantin से संशोधित मानव प्लाज्मा में कणों और सहकर्मियों के 22 से exosomes की शुद्धि के लिए एक प्रक्रिया विकसित की है। वायरस कणों उच्च में अलग जबकि Exosomes, कम घनत्व में iodixanol ढ़ाल के ऊपरी / अंशों को अलग करने के लिए पाए गएघनत्व / कम अंशों। वायरस कणों पी 24 एलिसा द्वारा की पहचान की गई और exosomes exosome मार्कर दर्द, CD9, CD63, और CD45 का उपयोग कर पहचान की गई। एकत्र ऊपरी कम घनत्व अंशों एचआईवी -1 पी 24 संदूषण के लिए नकारात्मक रहे थे जो exosomes निहित। मानव प्लाज्मा में एचआईवी के कणों से exosomes के कुशल शुद्धि और जुदाई मानव प्लाज्मा के साथ-साथ उनकी प्रतिरक्षा modulatory क्षमता की जांच और एचआईवी -1 रोगजनन में exosomes के नैदानिक और शकुन मूल्य से निकाली गई exosomes की सामग्री की सही परीक्षा के लिए अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीर्ण प्रतिरक्षा सक्रियण (सीआईए) और सीडी 4+ टी सेल कमी एचआईवी -1 संक्रमण के दो महत्वपूर्ण पहचान कर रहे हैं। वे सीआईए सबसे अच्छा कारक होने के साथ रोगजनन के लिए भविष्यवक्ताओं के रूप में स्थापित कर दिया गया ह…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
Referências
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