Isolering af Exosomer fra plasma af HIV-1 Positive Personer
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Exosomer er små vesikler varierer i størrelse fra 30 nm til 100 nm, der frigives både konstitutivt og ved stimulering fra en række celletyper. De findes i en række biologiske væsker og er kendt for at bære en række proteiner, lipider og nucleinsyre-molekyler. Oprindeligt menes at være lidt mere end reservoirer til celleaffald, er roller exosomer regulerer biologiske processer og i sygdomme i stigende grad værdsat.
Der er blevet beskrevet adskillige fremgangsmåder til isolering af exosomer fra cellulære dyrkningsmedier og biologiske væsker. På grund af deres lille størrelse og lav densitet, forskellen ultracentrifugering og / eller ultrafiltrering er de mest almindeligt anvendte teknikker til exosome isolation. Imidlertid plasma fra HIV-1-inficerede individer indeholder både exosomer og HIV virale partikler, som er ens i størrelse og tæthed. Således har en effektiv adskillelse af exosomer fra HIV virale partikler i humant plasma væreten udfordring.
For at løse denne begrænsning, har vi udviklet en procedure, modificeret fra Cantin et. al., 2008 til oprensning af exosomer fra HIV-partikler i humant plasma. Iodixanol hastighedsgradienter blev anvendt til at adskille exosomer fra HIV-1-partikler i plasmaet hos HIV-1-positive individer. Viruspartikler blev identificeret ved p24-ELISA. Blev identificeret exosomer på grundlag af exosom markører acetylcholinesterase (AChE), og CD9, CD63, CD45 og antigener. Vores gradient procedure gav exosom præparater fri for viruspartikler. Den effektive rensning af exosomer fra humant plasma muligt for os at undersøge indholdet af plasma-afledt exosomer og til at undersøge deres immunmodulerende potentiale og andre biologiske funktioner.
Introduction
HIV-1-epidemien fortsat have en betydelig indvirkning i hele verden. Som i 2013 blev omkring 35 millioner mennesker verden over lever med hiv, og 2,1 millioner af disse var nyligt inficerede individer 1. Forebyggelsesstrategier og øget adgang til antiretroviral behandling har været nyttige i at reducere den samlede overtagelse af HIV. Dog er enkelte befolkninger stadig oplever stigninger i købet af HIV 1. Således er der et behov for en fortsat indsats for at løse denne epidemi.
En af de stærkeste prædiktorer for HIV sygdomsprogression er kronisk immunaktivering (CIA) 2-10. Defineret ved vedvarende høje niveauer af detekterbare cytokiner og forhøjede ekspressionsniveauer markører på overfladen af T-lymfocytter, har CIA blevet tilskrevet: i) kontinuerlig dendritisk celle produktion af type I IFN 11; (ii) direkte immunaktivering drevet af HIV-proteiner Tat, Nef og gp120 12; (iii) Translokation af bakterielle proteiner i tarmrelateret immunceller 6. Den nøjagtige mekanisme (r) underliggende kronisk, systemisk immunrespons aktivering i HIV-infektion er dog stadig at blive fuldstændigt belyst.
Vores forskning gruppe og andre har vist en rolle exosomer i hiv patogenese 15-18. Vores gruppe har fastslået, at Nef proteinet udskilles fra inficerede celler i exosomer 15, og exosomal Nef (exNef) er til stede i plasma af HIV-inficerede individer på nanogram niveauer 18. Vi har vist, at bystander CD4 + -T-celler eksponeret for exNef resulterede i aktiverings-induceret celledød afhængig af CXCR4-vejen 19, 20. Alternativt monocyt / makrofager var refraktære over for exNef-induceret apoptose, men udviste ændrede cellulære funktioner og cytokinekspression. Senest har vores gruppe viste exosomer isoleret fra plasma fra HIV-inficerede individer indeholder en række pro-inflammatoriske cytokiner. Further, naive perifere mononukleare celler udsat for plasmaafledte exosomer fra HIV-inficerede patienter inducerede ekspression af CD38 på naive og centrale hukommelse CD4 + og CD8 + T-celler. Dette bidrager sandsynligvis systemisk inflammation og viral propagering via bystander-celleaktivering 21, og foreslår, at exosomer spiller en væsentlig rolle i HIV patogenese.
Ved at undersøge den rolle, exosomer i HIV-patogenese, er en udfordring at udvikle teknikker til effektivt adskilte exosomer fra HIV-partikler, samtidig med at indholdet exosomal samt deres funktionelle immunmodulerende kapacitet. Der er blevet beskrevet adskillige fremgangsmåder til isolering af exosomer fra cellekultur og biologiske væsker 22,23. På grund af deres lille størrelse og lav densitet (exosomer flyde ved en densitet på 1,15 – 1,19 g / ml), differential ultracentrifugering og / eller ultrafiltrering er de mest almindeligt anvendte teknikker til isolering exosome 23.Men HIV-inficeret celle kultursupernatanter og patienternes plasma indeholder både exosomer og HIV-1 viruspartikler. Exosomer og HIV-1-partikler er meget ens i både størrelse og tæthed. Alternativt udnytter ekspressionen af unikke exosomal markører, såsom CD63, CD45, CD81 og, exosomer er blevet isoleret under anvendelse af immunaffinitetskromatografi capture metoder 23. Denne procedure kan separere virus fra exosomer. Imidlertid er ulempen ved denne teknik er den tætte binding af antistoffer til de oprensede exosomer, som kunne interferere med vurderingen af immunmodulerende potentiale exosomer i kultur.
For at løse disse begrænsninger, har vi udviklet en procedure for rensning af exosomer fra HIV-partikler i humant plasma modificerede fra Cantin og kolleger 22 Brug iodixanol hastighedsgradienter. Exosomer blev fundet at adskille i lav-densitet / øvre fraktioner af iodixanol gradienter, mens viruspartikler adskilt i høj-densitet / lavere fraktioner. Viruspartikler blev identificeret ved p24 ELISA og exosomer blev identificeret under anvendelse exosom markører AChE, CD9, CD63, CD45 og. De øvre lav densitet opsamlede fraktioner indeholdt exosomer der var negative for HIV-1 p24 forurening. Den effektive rensning og adskillelse af exosomer fra HIV-partikler i humant plasma muliggør nøjagtig undersøgelse af indholdet af exosomer fra humant plasma samt undersøgelse af deres immunmodulerende potentiale og den diagnostiske og prognostiske værdi exosomer i HIV-1 patogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kronisk immunaktivering (CIA) og CD4 + T-celle depletion er to vigtige kendetegnende for HIV-1-infektion. De er blevet etableret som prædiktorer for patogenese, med CIA at være den bedste prædiktor. Men de underliggende mekanismer kørsel kronisk systemisk immun aktivering og CD4 + T-celle tilbagegang har stadig ikke fuldt belyst. Vi og andre laboratorier har udviklet fast beviser for, at exosomer udskilles fra HIV-1-inficerede celler spiller en rolle i begge stempler.
Den fortsatte inter…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
Referências
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). . UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O’Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
