Den foreslåede arbejde vurderer den diagnostiske potentiale direkte og forstærket overflade plasmon resonans (SPRI) assays, navnlig til påvisning af rekombinant humant væksthormon i spidse humant serum, ved at sammenligne SPRI resulterer direkte med kommercielt tilgængeligt enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.
Følsomme og selektive metoder til påvisning af humant væksthormon (hGH) over en bred vifte af koncentrationer (høje niveauer af 50-100 ng ml – 1 og minimumsniveauer for 0,03 ng ml – 1) i cirkulerende blod er afgørende som variable niveauer kan angiver ændret fysiologi. For eksempel kan vækstforstyrrelser forekommer i barndommen diagnosticeres ved at måle niveauet af hGH i blodet. Også misbrug af rekombinant hGH i sport ikke kun udgør et etisk problem, det præsenterer også alvorlige trusler mod misbrugeren sundhed. En populær strategi til måling hGH misbrug, beror på påvisningen af forholdet mellem 22 kDa hGH til den samlede hGH, som ikke-22 kDa endogene niveauer falder efter exogent rekombinant hGH (rhGH) administration. Overfladeplasmonresonans imaging (Spri) er en analytisk værktøj, der giver direkte (label-fri) overvågning og visualisering af biomolekylære interaktioner ved at registrere ændringer i det refraktive index støder op til sensoroverfladen i realtid. I modsætning hertil hyppigst anvendte kolorimetri, enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA) anvender enzymmærkede detektionsantistoffer indirekte måling af analytkoncentration efter tilsætning af et substrat, der inducerer en farveændring. For at øge afsløring følsomhed, bruger forstærket forårsb en sandwich-assay-format og nærinfrarøde quantum dots (QDs) for at øge signalstyrken. Efter direkte forårsb påvisning af rekombinant rhGH i spidse humant serum, er forårsb signalet forstærkes af den sekventielle injektion af detektionsantistof belagt med nær-infrarød QDs (Nano-Spri). I denne undersøgelse blev den diagnostiske potentiale for direkte og forstærkes forårsb vurderet til måling rhGH tilsat i humant serum og sammenlignet direkte med mulighederne i et kommercielt tilgængeligt ELISA-kit.
Humant væksthormon (hGH) er et 191 aminosyrer langt peptid (22 kDa), der produceres af hypofysen og frigives direkte ind i blodbanen. Interaktioner mellem hypothalamus peptid væksthormon-frigivende hormon (GHRH) og somatotropin inducere pulserende sekreter af hGH. Som et resultat, niveauer af hGH varierer fra højder i 50-100 ng / ml til lavpunkt i 0,03 ng / ml området fra 1. Mangel eller overskud af hGH i kroppen kan fremprovokere en bred vifte af unormale fysiologiske symptomer. For eksempel kan overskydende niveauer af hGH føre til gigantisme 2 og diabetes 3. Forarmet niveauer af hGH forårsage lavt blodsukker hos nyfødte, og svag knogletæthed og depression hos voksne 4.
Administrationen af rekombinant form af hGH (rhGH) forbedrer lean muskelmasse samtidig reducere kropsfedt. Som sådan, dette stof blev stof valg for professionelle og amatører, da det forbedrer fysiske styrke, som giver et advAntage i konkurrencesport. rhGH er forbudt af World Anti-Doping Agency (WADA) 5,6 og meget indsats fra internationale forskere har været fokuseret på at udvikle tests, der kan afsløre sin tilstedeværelse eller anabolske virkning.
Enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA) har været den foretrukne metode til bestemmelse af hGH i fuldblod 7. Selv ELISA er en pålidelig teknik tilbyder god følsomhed og selektivitet, er det relativt tids- og arbejdskrævende. Desuden ELISA afhængig af indirekte påvisning af hGH ved anvendelse af enzymatiske tags. I modsætning hertil overfladeplasmonresonans (SPR) tillader påvisning af hGH direkte uden anvendelsen af etiketter i realtid. Påvisningen princip bag SPR indebærer en måleoverflade bestående af et prisme, der er belagt med et tyndt metallag (guld eller sølv); når en monokromatisk polariseret lys interagerer med metaloverfladen, er "overfladeplasmoner" genereret. Bindingen af en analyttil en overfladereceptor immobiliseret på metaloverfladen forstyrrer resonanstilstande resulterer i en forskudt resonans dip, som derefter kan korreleres til analytkoncentrationen. SPR-baserede biosensorer er nu kommercielt tilgængelige, der tilbyder en real-time, label fri teknik til at overvåge biomolekylære bindende begivenheder og biokemiske reaktioner 8-10. For nylig blev forårsb udviklet som svar på behovet for multiplexing (dvs. overvågning af flere bindende begivenheder samtidigt), hvilket ikke var muligt i de klassiske SPR biosensorer. Således har forårsb opstået som et redskab til at overvåge flere bindende begivenheder på samme tid. Aktuelle forårsb systemer er baseret på mikroskopisk billeddannelse af en overflade, der er ophidset med lys ved en bestemt vinkel og bølgelængde 10. Billedet er derefter indfanget på en ladningskoblet indretning (CCD) array.
Til dato har der været et par SPR-baserede assays er udviklet til at detektere hGH 11-14. En særlig strategi, Kendt som isoformen metode 15, beror på påvisningen af forholdet mellem 22 kDa hGH til den samlede hGH, som ikke-22-kDa endogene niveauer falder efter exogent rhGH administration. For nylig, de Juan-Franco et al. 11 rapporteret om udviklingen af et SPR-baserede immunosensor til selektiv detektering af 22 kDa og 20 kDa hGH-isoformer i humane serumprøver. Monoklonale antistoffer specifikke for hver isoform blev immobiliseret direkte på guldet sensoren tillader måling af begge isoformer samtidigt i en enkelt injektion med en detektionsgrænse på 0,9 ng ml -1. Alternativt er SPR blevet anvendt til at screene antistoffer med høj specificitet til hGH 13. Hvis koncentrationen af målanalytten falder under Spri systemets detektionsgrænse (<nM), må man ty til at forstærke forårsb signal via udnyttelsen af nanopartikler (Nano-Spri). En sådan SPR-baseret amplifikation er veldokumenteret i litteraturen 16-19 for various typer af analyt og overflader.
I dette arbejde blev det analytiske potentiale forårsb og Nano-forårsb baserede biosensorer undersøgt, især til påvisning af rhGH i spidse humant serum, og sammenligning af dets detektionsevne direkte til ELISA. Følgende parametre vil blive gennemgået og overvejet: afsløring tid, følsomhed, kinetiske profil, reproducerbarhed og specificitet.
Uregelmæssige niveauer af hGH, et naturligt forekommende hormon, har været forbundet med talrige medicinske lidelser, som påvirker human vækst og udvikling. Desuden er exogen administration af rhGH almindeligvis anvendes af sportsfolk, selv om det er forbudt, som doteringsmiddel at forbedre deres ydeevne. Udfordringer i påvisning rhGH misbrug skyldes vanskeligheden ved at skelne eksogene hGH fra endogene form. Som sådan, den nuværende godkendt teknik til påvisning af eksogent hGH bygger på måling af forholdet mellem 22 kDa hGH isoform i forhold til 20 kDa isoform. Eftersom isoform test krav til måling af flere hGH isoformer samtidigt inden for en kort periode i en bred vifte af koncentrationer vi derfor overvejet forårsb platform som et perfekt match. Desuden endogent hGH plan svinge til et meget lavt niveau (0,03 ng / ml) i blodstrømmen derfor detektionssystemet skal kunne måle dette område komfortabelt med høj specificity. Som et resultat, har vi også undersøgt i dette studie potentialet i Nano-forårsb som et diagnostisk værktøj til hGH og sammenlignet det direkte med forårsb og den klassiske immunoassay ELISA.
Baseret på resultater opnået fra denne undersøgelse, den største fordel af forårsb og Nano-SPRI metode er, at der kan måles rhGH koncentrationer på en hurtigere måde i forhold til den mere konventionelle metode ELISA. En standard varighed for måling rhGH niveauer i én prøve med den direkte påvisningsmetode var 1 time mens Nano-forårsb krævede 2 timer på grund af de ekstra trin i processen. Samlet set med forårsb og Nano-forårsb eksperimenter, før injektion af en prøve, en kalibrering skridt er stærkt anbefales. Hertil kommer, at injektion af en rå prøve som humant serum resulterer i nogle ikke-specifikke interaktioner som følge heraf er det nødvendigt at injicere et højt saltindhold vaskebuffer til kun afsløre specifikke interaktioner. Det er også værd at bemærke, at en vask skridt er absolut nødvendigtefter indførelsen af blokerende molekyler til sensoroverfladen, for at fjerne ubundne molekyler. Med hensyn til ELISA tidskrav er langt større (~ 16-18 timer) til analyse af en prøve. En længere inkubationstid er nødvendig, da følsomheden af assayet forøges specielt til denne undersøgelse, som fokus var at sammenligne den nedre detektionsgrænse.
Valget af overfladekemien vil variere fra et program til et andet, og dette kunne realiseres som en af begrænsningen af forårsb teknik. I denne undersøgelse blev et bredt område og kombination af kemiske linkere og blokerende molekyler vurderes for at opnå den rette kombination for at observere optimal binding effektivitet rhGH til sensoroverfladen. For eksempel, i denne undersøgelse, kombinationen af BSA og PEG fungerede godt til at minimere ikke-specifikke interaktioner. Men i en tidligere undersøgelse 17, hvor capture ligand var en aptamerer, PEG alene tjente som den bedste blokerende molekyle. Variablerneder påvirker binding effektiviteten af analytten til ligand er også pH-afhængig, puffer og temperatur. Derfor, med et program, skal optimeres disse variabler. Desuden er det vigtigt at bestemme den optimale koncentration spotting af liganden til chipoverfladen. En titrering eksperimentere med en række koncentrationer af immobiliserede ligander udføres før initiering af studiet. Som for ELISA, et afgørende skridt i den procedure, der var at dekanteres vaskebufferen fra brønde ved at trykke mikropladen da dette sikrede nogen resterende væske er tilovers. Fjernelse af buffer vask med pipette ikke var tilstrækkelig, da eventuelle rester væske blandede sig med signalet læsning af målstikprøven.
Med henvisning til følsomhed, ELISA (1 ng / ml) er sammenlignelig med forårsb (3,61 ng / ml), men nano-Spri (9,20 pg / ml) forbedrer følsomheden af tre størrelsesordener, således at målinger ved de lavere biologiske niveauer af rhGH 0,03 ng / ml. Som vi tidligere rapporteret 16,17, er forbedringen signalet bibringes af NanoEnhancers tilskrives en masse belastning virkning, og den stærke kobling, der eksisterer mellem NIR fluoroforer og udbreder overfladeplasmoner for guld film nanostrukturer. Selvom, Nano-forårsb tilføjer et ekstra trin af proceduren, kan dette niveau af følsomhed udvide anvendelser af forårsb teknologi i forskellige forretninger.
Spri giver forskerne en fuld kinetiske profil (K D, K a og K d) af antistof / rhGH interaktion mens ELISA kan rapportere kun affinitet værdier. Variationskoefficienten (CV) var under 10% for forårsb (4,1%) og ELISA (6,5%), hvilket tyder på god reproducerbarhed. ELISA og SPRI affinitet værdier er anderledes, fordi de fangantistoffer immobiliseret på sensorchippen er forskellige fra antistoffer immobiliseret i ELISA plade med 96 brønde. Med hensyn til Nano-SPRI en højere CV værdi (20%) blev observeret. Der er flere parametre, der kan bidrage som en kilde til errors til CV bestemmelse. For eksempel med Nano-forårsb eksperimentet en meget lavere koncentration af analyt der måles, tilføjelse af NanoEnhancers tilføjer endnu et skridt i proceduren og eksperimentet blev udført manuelt. En meget god korrelation mellem Nano-SPRI og ELISA blev opnået til påvisning af rhGH i spidse humant serum. Endelig kan ELISA være en pålidelig teknik imidlertid selve metoden er tidskrævende, hvilket gør det vanskeligt at bruge i situationer, der kræver tidstro overvågning og multiplexing, som det er tilfældet med hGH. Desuden et mere attraktivt funktion, der ikke blev undersøgt direkte i denne undersøgelse, SPRI tilbyder over ELISA, er evnen til at måle hundredvis af interaktioner samtidigt i realtid. Derfor vil der i fremtiden vil Nano-forårsb metoden vurderes at opdage flere biomarkører samtidigt i realtid (multiplexing) til stede i serum ved forskellige koncentrationer for at undersøge dens potentiale som en levedygtig klinisk diagnostisk værktøj.
The authors have nothing to disclose.
NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.
Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
Nanostrip | Cyantek | ||
N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
SPR biochip | HORIBA | ||
SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |