Den foreslåtte arbeids vurderer den diagnostiske potensiale for direkte og forsterket overflate plasmon resonance imaging (Spri) analyser, særlig for påvisning av rekombinant humant veksthormon i pigg humant serum, ved å sammenligne Spri resulterer direkte med kommersielt tilgjengelig enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) kit.
Følsomme og selektive fremgangsmåter for påvisning av humant veksthormon (hGH) over et bredt spekter av konsentrasjoner (høye nivåer av 50-100 ng ml – 1, og minimale nivåer på 0,03 ng ml – 1) i sirkulerende blod er viktig som variable nivåer kan indikere endret fysiologi. For eksempel kan vekstforstyrrelser som opptrer i barndommen diagnostiseres ved å måle nivåene av hGH i blod. Også misbruk av rekombinant hGH i idrett ikke bare utgjør et etisk problem det presenterer også alvorlige helsetrusler til overgriperen. En populær strategi for måling av hGH misbruk, er avhengig av detektering av forholdet mellom 22 kDa hGH til total hGH, som ikke er 22 kDa endogene nivåer slipp etter eksogen rekombinant hGH (rhGH) administrering. Surface plasmonresonans imaging (spri) er et analytisk verktøy som tillater direkte (label-free) overvåking og visualisering av biomolekylære interaksjoner ved å registrere endringer i brytnings index i tilknytning til føleroverflaten i sann tid. I motsetning til dette, den mest brukte kolorimetrisk metode, enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) bruker enzym-merkede antistoffer til påvisning indirekte måle analyttkonsentrasjon etter tilsetning av et substrat som induserer en fargeendring. For å øke følsomhet, bruker forsterket spri en sandwich analyseformat og nær infrarøde kvanteprikker (QDS) for å øke signalstyrken. Etter direkte Spri påvisning av rekombinant rhGH i piggete human serum, er Spri signal forsterkes av sekvensiell injeksjon av deteksjonsantistoff belagt med nær-infrarød QDS (Nano-Spri). I denne studien ble det diagnostiske potensialet i direkte og forsterket Spri vurderes for å måle rhGH piggete i humant serum og sammenlignet direkte med egenskapene til en kommersielt tilgjengelig ELISA kit.
Menneskelig veksthormon (HGH) er en 191 aminosyrepeptid (22 kDa) produsert av hypofysen og direkte slippes ut i blodbanen. Interaksjoner mellom hypothalamus peptid veksthormon-frigjørende hormon (GHRH) og somatotropinet indusere pulsatile sekret av HGH. Som et resultat av nivåene av hGH variere fra høyder på 50-100 ng / ml til lavtrykk i 0,03 ng / ml området 1. Mangel eller overskudd av hGH i kroppen kan fremkalle et bredt spekter av unormale fysiologiske symptomer. For eksempel kan overskytende nivåer av hGH føre til gigantism 2 og diabetes tre. Utarmet nivåer av HGH føre til lavt blodsukker hos nyfødte, og svak beintetthet og depresjon hos voksne 4.
Administrasjon av rekombinant form av hGH (rhGH) forbedrer muskelmasse og samtidig redusere kroppsfett. Som sådan, ble dette stoffet stoffet av valget for profesjonelle og amatører idrettsutøvere som det forbedrer fysisk styrke som overfører en advantage i konkurranseidrett. rhGH er bannlyst av World Anti-Doping Agency (WADA) 5,6 og mye innsats fra internasjonale forskere har fokusert på å utvikle tester som kan oppdage sin tilstedeværelse eller anabole effekten.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) har vært den foretrukne fremgangsmåten for bestemmelse av hGH i fullblod 7. Selv er ELISA en pålitelig teknikk gir god følsomhet og selektivitet, er det relativt tid- og arbeidskrevende. I tillegg bygger ELISA på indirekte påvisning av hGH ved å ansette enzymatiske tags. I motsetning til dette, overflate-plasmonresonans (SPR) muliggjør deteksjon av hGH direkte uten bruk av etiketter i sanntid. Påvisningen Prinsippet bak SPR omfatter en sensoroverflate som består av et prisme som er belagt med et tynt metall-lag (gull eller sølv); når en monokromatisk polarisert lys samhandler med metalloverflaten, er "overflateplasmons" generert. Bindingen av en analytttil en overflatereseptor immobilisert på metalloverflaten perturbs resonansbetingelser som resulterer i en forskjøvet resonans dip, som deretter kan korreleres til analyttkonsentrasjonen. SPR-baserte biosensorer er nå kommersielt tilgjengelig som tilbyr en real-time, etikett fri teknikk for å overvåke biomolekylære bindende hendelser og biokjemiske reaksjoner 8-10. Mer nylig ble Spri utviklet som svar på behovet for multipleksing (dvs. overvåke flere bindingsbegivenheter samtidig), som ikke var mulig i klassiske SPR biosensorer. Dermed har spri dukket opp som et verktøy for å overvåke flere bindende hendelser samtidig. Nåværende Spri systemer er basert på mikroskopisk avbildning av en overflate som eksiteres med lys ved en spesifikk vinkel og 10 bølgelengde. Bildet blir deretter tatt bort på en CCD (CCD) matrise.
Hittil har det vært et par SPR-baserte analyser utviklet for å oppdage hGH 11-14. En spesiell strategi, Kjent som isoform metode 15, er avhengig av detektering av forholdet mellom 22 kDa hGH til total hGH, som ikke er 22-kDa endogene nivåer slipp etter eksogen rhGH administrering. Nylig har de Juan-Franco et al. 11 rapportert på utvikling av et SPR-baserte immunosensor for selektiv detektering av 22 kDa og 20 kDa hGH-isoformer i humane serumprøver. Monoklonale antistoffer som er spesifikke for hver isoform ble immobilisert direkte på gull sensoren tillater måling av begge isoformer samtidig i en enkelt injeksjon med en deteksjonsgrense ved 0,9 ng ml -1. Alternativt har SPR blitt brukt til å screene antistoffer med høy spesifisitet til hGH 13. Dersom konsentrasjonen av målanalytten faller under spri systemets deteksjonsgrensen (<nM), må man ty til å forsterke Spri signal via utnyttelse av nanopartikler (Nano-Spri). Slik SPR-basert amplifikasjon er godt dokumentert i litteraturen 16-19 for various typer analytt og overflater.
I dette arbeidet ble det analytiske potensialet i spri og Nano-Spri baserte biosensorer undersøkt, særlig for deteksjon av rhGH i pigg humant serum, og sammenligning av dets evne til direkte deteksjon til ELISA. Følgende parametere skal gjennomgås og vurderes: deteksjon tid, følsomhet, kinetisk profil, reproduserbarhet og spesifisitet.
Uregelmessige nivåer av HGH, et naturlig forekommende hormon, har vært knyttet til en rekke medisinske lidelser som påvirker menneskelig vekst og utvikling. Videre er eksogene administrasjon av rhGH ofte brukt av idrettsutøvere, selv om det er forbudt, som et dopingmiddel for å forbedre sine resultater. Utfordringer i å oppdage rhGH misbruk resultatet fra vanskeligheter med å skille eksogene hGH fra endogene formen. Som sådan, den nåværende godkjente teknikk for detektering av eksogent hGH er avhengig av måling av forholdet mellom den 22 kDa hGH isoform i forhold til det 20 kDa isoformen. Siden isoform test krav til måling av fler hGH-isoformer samtidig innenfor en kort tidsperiode i et bredt konsentrasjonsområde, derfor, vurderte vi Spri plattformen som en perfekt match. I tillegg endogent hGH-nivå svinge til et svært lavt nivå (0,03 ng / ml) i blodstrømmen derfor deteksjonssystemet må være i stand til å måle denne serien komfortabelt med høy specificity. Som et resultat har vi også undersøkt i dette studiet potensialet av Nano-Spri som et diagnostisk verktøy for hGH og sammenlignet direkte med Spri og klassisk ELISA immunologisk analyse.
Basert på resultatene oppnådd fra denne studien, er den viktigste fordel av Spri og Nano-Spri metode som rhGH konsentrasjoner kan måles på en raskere måte i forhold til de mer konvensjonelle metoden ELISA. En standard varighet for måling av rhGH nivåer i en prøve med den direkte deteksjonsmetoden var en time, mens den Nano-Spri kreves to timer på grunn av de ytterligere trinn i prosessen. Samlet med spri og Nano-spri eksperimenter, før injeksjon av en prøve, en kalibreringstrinn er sterkt anbefalt. I tillegg har injeksjon av en rå prøve av humant serum som resulterer i noen ikke-spesifikke interaksjoner som et resultat er det viktig å injisere en høy saltvaskebuffer til bare å vise spesifikke interaksjoner. Det er også verdt å merke seg at et vasketrinn er helt nødvendigetter innføringen av blokkering molekyler til sensoroverflaten, for å fjerne ubundne molekyler. Som for ELISA tidskrav er langt høyere (~ 16 til 18 timer) for analyse av en prøve. En lengre inkubasjonstid er nødvendig som analysens følsomhet forbedres spesielt for denne studien, som fokus var å sammenligne den nedre deteksjonsgrense.
Valget av overflatekjemi vil variere fra en anvendelse til en annen, og dette kan bli realisert som en av begrensningen av Spri teknikk. I denne studien ble et stort utvalg og kombinasjon av kjemiske linkere og blokkerer molekyler vurderes for å oppnå riktig kombinasjon for å observere binding optimal effektivitet av rhGH til sensoroverflaten. For eksempel, i denne studien, er kombinasjonen av PEG og BSA tjente også til å minimalisere ikke-spesifikke interaksjoner. I en tidligere studie 17, hvor fangst ligand var et aptamerer, PEG alene tjente som den beste blokkerings molekylet. Variablenesom påvirker bindingseffektivitet av analytt til ligand er også avhengig av pH-verdi, buffer og temperatur. Derfor, med alle programmer, disse variablene må optimaliseres. I tillegg er det viktig å bestemme den optimale spotting konsentrasjonen av liganden til chip overflaten. En titrering forsøk med en rekke konsentrasjoner av immobiliserte ligander utføres før initiering av studien. Som for ELISA, et viktig skritt i prosedyren var å dekantere vaskebuffer fra brønner ved å peke på mikro som dette sikres ingen gjenværende væske er leftover. Fjerning av bufferen vask med pipette var ikke nok, da eventuelle rester av væske blandet med det signal lesning av målet prøven.
Under henvisning til følsomhet, ELISA (1 ng / ml) er sammenlignbare med Spri (3,61 ng / ml), men nano-Spri (9,20 pg / ml) forbedrer følsomheten ved tre størrelsesordener, for derved å muliggjøre målinger på de lavere biologiske nivåer av rhGH 0,03 ng / ml. Som vi tidligere har rapportert pt6,17, blir den signalforbedring formidles av NanoEnhancers tilskrives en masse lasteeffekt og den sterke kobling som eksisterer mellom NIR fluoroforer og som forplanter seg på overflaten plasmons for gull filmnanostrukturer. Selv om, legger Nano-spri et ekstra trinn til prosedyren, kan dette nivået av følsomhet utvide anvendelser av spri teknologi i ulike utsalgssteder.
Spri gir forskere en full kinetisk profil (K D, K a og K d) av antistoff / rhGH interaksjon mens ELISA kan rapportere bare Affinitetsverdiene. Variasjonskoeffisienten (CV) var under 10% for Spri (4,1%) og ELISA (6,5%), noe som tyder på god reproduserbarhet. ELISA og Spri Affinitetsverdiene er forskjellige fordi registrerings antistoffene immobilisert på sensorbrikken er forskjellige fra antistoffer immobilisert på ELISA 96-brønners plate. Som for Nano-Spri en høyere CV-verdi (20%) ble observert. Det er flere parametere som kan bidra som en kilde til errors for CV besluttsomhet. For eksempel, med Nano-Spri eksperiment ble en mye lavere konsentrasjon av analytt som blir målt, gir tilsetningen av NanoEnhancers et nytt skritt i fremgangsmåten, og eksperimentet ble utført manuelt. En meget god korrelasjon mellom Nano-Spri og ELISA ble oppnådd for påvisning av rhGH i spiked humant serum. Endelig kan ELISA være en pålitelig teknikk, men fremgangsmåten i seg selv er tidkrevende som gjør det vanskelig å bruke i situasjoner som krever sanntidsovervåking og multipleksing, som det er tilfellet med hGH. I tillegg er et mer tiltalende funksjon som ikke ble undersøkt direkte i denne studien som Spri tilbyr over ELISA, er evnen til å måle hundrevis av interaksjoner samtidig i sanntid. Derfor i fremtiden, vil Nano-spri metoden vurderes å oppdage flere biomarkører samtidig i sanntid (multiplexing) til stede i serum ved ulike konsentrasjoner for å undersøke dens potensial som en levedyktig klinisk diagnostisk verktøy.
The authors have nothing to disclose.
NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.
Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
Nanostrip | Cyantek | ||
N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
SPR biochip | HORIBA | ||
SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |