Fosfoinositídeos estão sinalizando lipídios, cuja abundância relativa muda rapidamente em resposta a vários estímulos. Este artigo descreve um método para medir a abundância de fosfoinositídeos por meio de rotulagem metabolicamente células com 3 H- mio-inositol, seguido por extracção e desacilação. Extraídos glicero-inositides são então separados por cromatografia líquida de alto desempenho e quantificadas por cintilação fluxo.
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Artigo de método
Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os fosfoinositídeos (PtdInsPs) são lipídios sinalizadores essenciais responsáveis por recrutar efetores específicos e conferir às organelas identidade e função molecular. Cada um dos sete PtdInsPs varia em sua distribuição e abundância, que são rigidamente regulados por quinases e fosfatases específicas. A abundância de PtdInsPs pode mudar abruptamente em resposta a vários eventos de sinalização ou perturbação da maquinaria reguladora. Para entender como esses eventos levam a mudanças na quantidade de PtdInsPs e seu impacto resultante, é importante quantificar os níveis de PtdInsP antes e depois de um evento de sinalização ou entre o controle e as condições anormais. No entanto, devido à sua baixa abundância e semelhança, quantificar as quantidades relativas de cada PtdInsP pode ser um desafio. Este artigo descreve um método para quantificar os níveis de PtdInsP marcando metabolicamente as células com 3H-mio-inositol, que é incorporado ao PtdInsPs. Os fosfolipídios são então precipitados e desacilados. Os 3H-glicero-inositídeos solúveis resultantes são posteriormente extraídos, separados por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) e detectados por cintilação de fluxo. A rotulagem e o processamento de amostras de levedura são descritos em detalhes, bem como a configuração instrumental para o HPLC e o cintilador de fluxo. Apesar de perder informações estruturais sobre o conteúdo da cadeia acila, este método é sensível e pode ser otimizado para quantificar simultaneamente todos os sete PtdInsPs nas células.
Introdução
Os fosfoinositídeos (PtdInsPs) são importantes fosfolipídios sinalizadores que ajudam a regular uma variedade de funções celulares, incluindo transdução de sinal, tráfego de membrana e expressão gênica, que então modulam o comportamento celular de ordem superior, como divisão celular, identidade de organelas e atividade metabólica1-3. Existem sete espécies de PtdInsPs que são derivadas da fosforilação das posições 3, 4 e/ou 5 do grupo de cabeça de inositol do fosfatidilinositol (PtdIns), o fosfolipídio original. É importante ressaltar que os sete PtdInsPs são distribuídos de forma desigual e a concentração local de cada espécie de PtdInsP pode aumentar ou d....
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Protocolo
Nota: O texto abaixo descreve em pormenor um método para medir PtdInsPs em leveduras. Ele fornece os detalhes experimentais para as células de levedura de rotulagem com 3 H- mio-inositol, extraindo e desacilando lipídios e um protocolo de HPLC-eluição para fracionar e quantificar PtdInsPs desacilados. Por favor, note que a rotulagem, a desacilação, resolução e quantificação de PtdInsPs em células de mamíferos requerem otimização e perfis de HPLC-eluição mais longos. Esses detalhes podem ser encontrados em outros lugares, embora nós discutir alguns dos aspectos na discussão. Em geral, a metodologia para extrair os lípidos, desacilar e extrair o sol....
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Resultados
Usando este método, PtdInsPs de levedura foram marcadas metabolicamente com H-3 mio-inositol. Após marcação, os fosfolípidos foram precipitados com ácido perclórico, seguida por desacilação e fosfolípido extracção do Gro-InsPs solúvel em água (Figura 1). Nesta fase, é importante para quantificar o sinal radioactivo associado ao total de extraiu-Gro-InsPs por cintilação líquida para garantir suficiente rácio de sinal para ruído para os PtdInsPs muito b.......
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Discussão
Este artigo detalha o protocolo experimental necessária para quantificar os níveis celulares de PtdnsPs por acoplado-HPLC fluxo de cintilação de levedura. A metodologia permite que a marcação metabólica de PtdInsPs com 3 H-mio-inositol, seguido de processamento e extracção de lípido solúvel em água 3H-Gro-InsPs, fraccionamento por HPLC e análise. Usando este método, os níveis relativos de PtdInsPs em células sob várias condições pode ser quantificada, como é mostrado para PtdIns (3,5) P
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
C.Y.H. foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação de Ontário do Governo de Ontário. Este artigo foi possível graças ao financiamento mantido pela R.J.B. do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia, do Programa de Cátedras de Pesquisa do Canadá e da Universidade Ryerson.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Fosfato |
| de amônio de grau reagente dibásico | Bioshop | APD001 | Sulfato de amônio de grau ACS |
| Biobasic | ADB0060 | Amostrador automático de grau ultra puro | |
| Agilent | G1329B | Agilent 1260 série infinita | |
| Biotina | Sigma | B4501 | |
| Ácido bórico | Biobasic | BB0044 | de grau de biologia molecular |
| Biobasic | CT1330 | Anidro, | |
| pantotenato de cálcio | Sigma | C8731 | |
| Sulfato de cobre (II) | Sigma | 451657 | anidra |
| Biobasic | GB0219 | Anidro, modificação | |
| Dulbecco de grau biotecnológico de Eagle's Medium | Life | 11995-065 | Com 4,5 g/L de glicose, 110 mg/L de piruato, L-glutamina |
| Modificação de Dulbecco da Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | Com 4,5 g/L de glicose, sem L-gluatamina, sem inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Éter etílico ultra puro livre de ácido |
| Caledon labs | 1/10/4700 | Formato etílico de grau reagente | |
| Sigma | 112682 | grau reagente | |
| Wisent | 080-450 | Origem dos EUA, qualidade premium, inativado por calor | |
| Soro fetal bovino, Vida Dialisada | 26400044 | EUA origem | |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Fluido de cintilação para cintilação de fluxo |
| Ácido fólico | Biobasic | FB0466 | |
| USP grau HEPES solução tampão | 15630080 vida útil | M solução | |
| Inositol, Myo- [2-3H (N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9: 1 etanol para água |
| Insulina-Transferrina-Selênio-Etanolamina | Vida 51500056 | solução 100x | |
| Cloreto de ferro (III) | Sigma | 157740 | Reagente grau |
| Laura - Software de coleta e análise de dados de cromatografia | LabLogic Systems Ltd | Versão 4.2.1.18 | Software de cintilador de fluxo |
| L-glutamina | Sigma | G7513 | 200 mM, em solução, filtrado estéril, BioXtra, adequado para cultura de células |
| Cloreto de magnésio | Sigma | M8266 | |
| Sulfato de manganês | Biobasic | MB0334 | Monohidratado, grau ACS |
| Metanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC |
| Grau solução de metilamina | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Fosfato monopotássico | Biobasic | PB0445 | Anidro, Ácido nicotínico de grau ACS |
| Biobasic | NB0660 | Grau de reagente | |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | Software para HPLC |
| ácido p-aminobenzóico (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | |
| Penicilina-estreptomicina | Sigma | P4333 | 100X, líquido, estabilizado, filtrado estéril, testado em cultura de células |
| Ácido perclórico | Sigma | 244252 | reagente ACS, 70% |
| PhenoSpher SAX coluna | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µ m, 80 &, 250 x 4,6 mm |
| Ácido fosfórico | Caledon labs | 29/01/8425 | de grau reagente |
| Biobasic | PB0440 | de grau ACS | |
| Biobasic | PB0443 | de grau ACS | |
| Sigma | P9755 | ||
| Bomba quaternária | Agilent | G1311C | Agilent 1260 série infinita |
| Riboflavina | Bioshop | RIB333.100 | |
| Cloreto de sódio | Biobasic | DB0483 | |
| Molibdato de sódio | Sigma | 243655 | |
| Compartimento de coluna termostatizado | Agilent | G1316A | Agilent 1260 série infinita |
| Cloridrato de tiamina | Sigma | T4625 | Grau de reagente; fazer solução de 0,02% (p / v), forma uma suspensão. misture e congele alíquotas |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Coquetel de cintilação para contagem de cintilação líquida |
| Sulfato de zinco | Biobasic | ZB2906 | Heptahidratado, grau de reagente |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µ l célula de fluxo; Analisador de Cintilador de Fluxo Radiomático alternativo da Perkin Elmer; |
Referências
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
- Botelho, R. J.
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Reimpressões e permissões
