Högupplösta Kvantitativ immunogold Analys av membranreceptorer på näthinnan Ribbon synapser
Summary
The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.
Abstract
Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.
Introduction
Glutamat är den huvudsakliga excitatoriska neurotransmittorn i näthinnan 1. Näthinneganglieceller (RGC), som får glutamaterg synaptisk input från bipolära celler 2, är utgångs nervceller i näthinnan som skickar visuell information till hjärnan. Fysiologiska studier visade att synaptiska excitering av RGC förmedlas postsynaptiskt av NMDA-receptorer (NMDARs) och AMPA-receptorer (AMPARs) 3,4,5. Även excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs) i RGC förmedlas av AMPARs och NMDARs 3,5,6,7,8, spontana miniatyr EPSCs (mEPSCs) på RGC uppvisar endast en AMPARs-medierad komponent 4,5,9. Emellertid minskar glutamatupptaget avslöjade en NMDAR komponent i spontana EPSCs 5, vilket tyder på att NMDARs på RGC dendriter kan vara belägna utanför av excitatoriska synapser. Membranassocierade guanylat kinaser (MAGUKs) såsom PSD-95 att klusterneurotransmittorreceptorer, inklusive glutamatreceptorer och jonkanals vid synaptiska platser, även uppvisar tydliga subsynaptic uttrycksmönster 10,11,12,13,14.
Under de senaste decennierna, konfokal immunohistokemi och pre-inbäddning elektronmikroskop (EM) immunohistokemi har använts för att studera membranreceptoruttryck. Även konfokal immunfärgning avslöjar breda mönster av receptoruttryck, gör sin lägre upplösning det omöjligt att använda för att skilja subcellulär plats. Pre-inbäddning EM studier i däggdjur näthinnan visar att NMDAR subenheter finns i postsynaptiska element vid kon bipolär cell band synapser 15,16,17. Detta är i uppenbar kontrast till fysiologiska bevis. Emellertid är diffusionen av reaktionsprodukten ett välkänt artefakt i pre-inbäddning immunoperoxidas-metoden. Därför innebär detta synsätt inte brukar ge statistiskt tillförlitliga uppgifter och kan utesluta åtskillnad mellan lokalisering till synaptiska membranet kontra extrasynaptic membran 18,19,20,21. PåDäremot fysiologiska och anatomiska data överensstämmer med en synaptiska lokalisering av AMPARs på RGC 3,5,7,9,22. Sålunda är glutamatreceptorer och MAGUKs vid retinal band synaps lokaliserade inte bara för att den postsynaptiska utan även för de perisynaptic eller extrasynaptic membran fack. Dock krävs fortfarande en hög upplösning kvantitativ analys av dessa membranproteiner i en retinal band synaps.
Här har vi utvecklat en postembedding EM immunogold teknik för att undersöka subsynaptic lokalisering av NMDAR subenheter, Ampar subenheter och PSD-95 följt av att uppskatta antalet, densiteten och variationen av dessa proteiner vid synapser på råtta RGC märks med koleratoxin subenhet B (CTB) retrograda spårning metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrivit fyra tekniker för framgångsrik kvantitativ efter inbäddning immunogold EM: 1) kort och svag fixering, 2) frys substitution, 3) efter inbäddning immunogold färgning och 4) kvantifiering.
EM immunoguld medger detektion av specifika proteiner i ultratunna vävnadssnitt. Antikroppar märkta med guldpartiklar kan direkt visualiseras med EM. Medan kraftfulla i att detektera subsynaptic lokaliseringen av en membranreceptor, kan EM immunogold vara tekniskt utmanande och kräver…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Intramural Program för National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (NINDS) och National Institute on Dövhet och andra kommunikationsstörningar (NIDCD), av National Institutes of Health (NIH). Vi tackar NINDS EM anläggningen och NIDCD avancerad bildbehandling kärna (kod # Zic DC 000.081 till 03) för att få hjälp.
Materials
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultromicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4000 |
Referências
- Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
- Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
- Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
- Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
- Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
- Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
- Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
- Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350 (1995).
- Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
- Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
- Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
- Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
- Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
- Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J., Ariano, M. A. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. , 46-74 (1998).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
- Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
- Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
- Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , (1991).
- Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
- Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
- Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
- Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neurociência. 167, 68-87 (2010).
- Merighi, A., Polak, J. M., Priestley, J. V. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. , 51-87 (1992).
- Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
- Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
- Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
- Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
- Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).
