ДНК Электропорация, Изоляция и изображений из мышечных волокон
Summary
This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Abstract
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
Introduction
Отдельные мышечные волокна большие, высоко организованные синцитиальный клетки. Есть несколько моделей клеточных культур для мышц; Однако, эти модели имеют в качестве основного ограничения, что они полностью не дифференцируются в зрелые мышечные волокна. Например, клеточные линии C2C12 и L6 получены из мышей и крыс, соответственно 1-4. В условиях сывороточного голодания, мононуклеарные "миобластов, как" клетки перестают пролиферацию, пройти выходе клеточного цикла, и введите в программу, сформировав миогенной многоядерные клетки с саркомеров, называют мышечные трубки. При длительном условиях культивирования, мышечные трубки могут проявлять свойства сократительных и "дергаться" в культуре. Линии клеток человека также теперь установлено 5. В дополнение к этим линии иммортализованных клеток, мононуклеарных миобласты могут быть выделены из мышцы и под аналогичных условиях сывороточного голодания будет образовывать мышечные трубки. Эти клеточные линии и первичные культуры миобластов сильно использоватьFUL, потому что они могут быть трансфицированы плазмидами или вирусами, трансдуцированных и используется для изучения биологических процессов основной ячейки. Тем не менее, эти клетки, даже когда индуцированное с образованием мышечных трубках, лишены многих характерных особенностей зрелой организации мышцы. В частности, мышечные трубки намного меньше, чем отдельных мышечных волокон и зрелых хватает нормальной формы мышечных волокон. Критически, мышечные трубки не хватает поперечные (Т) канальцы, перепончатый сети необходимы для эффективной Са 2+ выпуска по всему myoplasm.
Альтернативный метод первичной миобластов или миогенных клеточных линий влечет за собой использование зрелых мышечные волокна. Трансгенез могут быть использованы для установления экспрессии меченных белков, но этот метод является дорогостоящим и трудоемким. В естественных электропорации мышцы мыши стала предпочтительным способом для его скорость и надежность 6-10.
Методы электропорации в естественных условиях и эффективного выделения миофибрилл гаве были оптимизированы для мыши сгибатель пальцев Brevis (FDB) мышцы 6. Эти методы могут быть завершены легко и малоинвазивная, чтобы вызвать в естественных условиях выражения из плазмид. Этот подход в настоящее время в сочетании с методами визуализации с высоким разрешением, включая изображения после лазерной нарушения сарколеммы 6,7. Сочетание флуоресцентных красителей и экспрессии белков флуоресцентно меченных может быть использован для мониторинга биологических процессов клеток в зрелые мышечные волокна.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование электропорации для изучения флуоресцентно меченных белков в естественных условиях идеально подходит для изучения данного мышцы отсутствие подходящих моделей линии клеток, которые точно повторяют всю структуру клеток мышц. Этот протокол описывает использование э…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здоровья дает NS047726, NS072027 и AR052646.
Materials
| DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
| Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
| 1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
References
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).
