DNA Eletroporação, Isolamento e imagem das miofibras
Summary
This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Abstract
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
Introduction
Myofibers individuais são células sinciciais grandes, altamente organizados. Existem alguns modelos de cultura celular para o músculo; No entanto, estes modelos têm como principal limitação que não diferenciar plenamente em myofibers maduros. Por exemplo, as linhas de células C2C12 e L6 são derivados de ratinhos e ratos, respectivamente 1-4. Sob condições de privação de soro, as células mononucleares "mioblastos-like" cessar proliferação, submetido a retirada do ciclo celular, e entrar no programa miogênica formando células multinucleadas com sarcômeros, referido como myotubes. Com condições de cultura prolongados, myotubes podem exibir propriedades contráteis e "contração" na cultura. Linhas de células humanas têm também sido agora estabelecido 5. Em adição a estas linhas celulares imortalizadas, mioblastos mononucleares podem ser isoladas a partir do músculo e sob as mesmas condições de privação de soro irá formar miotubos. Estas linhas celulares e culturas primárias de mioblastos são altamente usarful porque eles podem ser transf ectadas com plasmídeos ou transduzidas com vírus e utilizado para estudar processos celulares biológicas básicas. No entanto, essas células, mesmo quando induzidos a formar miotubos, não têm muitas das características marcantes da organização músculo maduro. Especificamente, miotubos são muito menores do que miofibras maduras individuais e não têm a forma normal de miofibras. Criticamente, myotubes falta transversais (T-) túbulos, a rede membranoso necessária para eficiente liberação de Ca2 + em todo o myoplasm.
Um método alternativo para mioblastos primários ou linhas de células miogénicas implica a utilização de miofibras maduras. Transgénese pode ser utilizada para determinar a expressão de proteínas marcadas, mas este método é dispendioso e demorado. Electroporação in vivo de músculo do rato tem surgido como um método preferido para a sua velocidade e fiabilidade 6-10.
Métodos para electroporação in vivo e o isolamento eficiente de miofibras have foi otimizado para o flexor digitorum brevis rato (FDB) 6. Os métodos podem ser prontamente concluída e são minimamente invasiva para induzir a expressão in vivo a partir de plasmídeos. Esta abordagem é agora combinado com métodos de imagem de alta resolução de imagem, incluindo após a interrupção do laser do sarcolema 6,7. A combinação de corantes fluorescentes e de expressão de proteínas marcado por fluorescência pode ser utilizado para monitorar os processos biológicos das células em miofibras maduras.
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso de electroporação para estudar as proteínas marcadas por fluorescência in vivo, é idealmente adequado para o estudo do músculo devido à ausência de modelos de linhas celulares adequadas que reproduzem com fidelidade a estrutura da célula de músculo inteira. Este protocolo descreve a utilização de electroporação e microscopia confocal de alta resolução para fornecer imagens detalhadas de localização de proteínas e translocação após o ferimento a laser. Este método pode ser adaptado p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede NS047726, NS072027, e AR052646.
Materials
| DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
| Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
| 1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
Referências
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).
